單側(cè)甲狀腺電凝毀損法構(gòu)建大鼠亞臨床甲狀腺功能減退癥模型

葛金芳，趙 斌，彭 磊，吳婷妮，解雪峰，胡成穆

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032)

單側(cè)甲狀腺電凝毀損法構(gòu)建大鼠亞臨床甲狀腺功能減退癥模型

葛金芳，趙 斌，彭 磊，吳婷妮，解雪峰，胡成穆

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032)

目的 評(píng)價(jià)單側(cè)甲狀腺電凝毀損法建立大鼠亞臨床甲狀腺功能減退癥模型的可行性。方法 36只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、亞臨床甲狀腺功能減退癥組和臨床甲狀腺功能減退癥組。亞臨床甲狀腺功能減退癥組大鼠電凝毀損單側(cè)甲狀腺，臨床甲狀腺功能減退癥組大鼠電凝毀損全部甲狀腺，假手術(shù)組暴露甲狀腺而不毀損。飼養(yǎng)2周后，相同時(shí)間組間平行采血、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清TSH、fT4、T3水平，光鏡下觀察亞臨床甲狀腺功能減退癥組大鼠對(duì)側(cè)甲狀腺組織病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，大鼠單側(cè)電凝毀損甲狀腺術(shù)后2周血清TSH水平輕度升高而T3、fT4則無顯著變化，殘留甲狀腺組織輕度增生，符合亞臨床甲狀腺功能減退癥的特征;大鼠雙側(cè)電凝毀損甲狀腺2周后血清T3、fT4顯著下降、TSH水平顯著升高，符合臨床甲狀腺功能減退癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論 單側(cè)甲狀腺電凝毀損法建立大鼠亞臨床甲狀腺功能減退癥模型是用于研究亞臨床甲狀腺功能減退癥發(fā)生及發(fā)展機(jī)制的簡(jiǎn)便可靠模型。

亞臨床甲狀腺功能減退癥，亞臨床甲減，亞甲減;模型;甲狀腺

亞臨床甲減癥的危害已經(jīng)得到臨床證實(shí)，但其致病的機(jī)制尚不清楚，對(duì)其是否需要治療也存在爭(zhēng)議［5］。鑒于倫理學(xué)和人體研究難以實(shí)現(xiàn)的原因，建立亞臨床甲減癥的動(dòng)物模型對(duì)于研究亞臨床甲減的病因、發(fā)病機(jī)制及是否需要治療、治療是否有效等都非常必要。本研究在參照大鼠甲狀腺切除術(shù)后補(bǔ)充甲狀腺方法的基礎(chǔ)上，采用單側(cè)甲狀腺電凝毀損術(shù)，以血清T3、fT4和 TSH為診斷依據(jù)，同時(shí)觀察殘留甲狀腺組織病理形態(tài)學(xué)改變，探索亞臨床甲減癥大鼠模型的造模方法。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：Wistar大鼠36只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±10)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(滬)2007-0005］。飼養(yǎng)于無毒塑料盒中，每盒5只，控制12 h晝夜周期，自由攝食和飲水，保持室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度40% ～60%，自然光照，每2 d更換墊料1次。

1.1.2 試劑與儀器：水合氯醛，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20090605;RF-1雙極電凝器，上海市檢測(cè)技術(shù)所上立檢測(cè)儀器廠生產(chǎn);高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品;XSZ-H生物顯微鏡，重慶光電儀器總公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠亞臨床甲減癥模型制作：Wistar大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、亞臨床甲減癥組(SCH)和臨床甲減癥(CH)組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，10%水合氯醛(3 mL/kg)ip麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺(tái)，常規(guī)消毒，縱向切開頸部皮膚，逐層分離，暴露氣管，亞臨床甲減癥組大鼠使用RF-1雙極電凝器，24W高頻功率電凝毀損右側(cè)及峽部甲狀腺組織(保留左側(cè)甲狀腺)，臨床甲減癥組使用同樣方法毀損全部甲狀腺組織，假手術(shù)組則暴露甲狀腺而不進(jìn)行電凝毀損。毀損后清除壞死組織，縫合。術(shù)后飼以普通飼料和飲水，每4d記錄體重一次。

1.2.2 血清 TSH、TT4檢測(cè)：2周后10%水合氯醛(3 mL/kg)ip麻醉大鼠，上午 9：00～11：00腹主動(dòng)脈取血，各組平行進(jìn)行。4℃，3000 r/min，離心10 min，分離血清，-80℃保存。標(biāo)本送安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清TSH、fT4、T3 水平。

1.2.3 甲狀腺組織病理形態(tài)學(xué)觀察：取血后，假手術(shù)對(duì)照組和亞臨床甲減癥組大鼠取左側(cè)甲狀腺組織，4%PFA固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，HE染色。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包(Statistical Package for the Social Science，SPSS)13.0版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以(ˉx±s)表示，單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)后LSD檢驗(yàn)比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模后，臨床甲減癥組大鼠出現(xiàn)倦怠、活動(dòng)減少、毛發(fā)逐漸失去光澤、與假手術(shù)組比較 體重增長(zhǎng)緩慢甚至減輕(P＜0.05)，第3天死亡1只。而亞臨床甲減癥組大鼠則在手術(shù)2 d后回復(fù)至正常狀態(tài)，無死亡，體重與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。具體見圖1。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠無聲音嘶啞癥狀出現(xiàn)，飲水無嗆咳。

圖1 單側(cè)甲狀腺電凝毀損對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)的影響(ˉx±s)Fig.1 Effect of hemi-thyroid electrocoagulation on the body weight of rats(ˉx±s)

2.2 單側(cè)甲狀腺電凝毀損對(duì)大鼠血清TSH、fT4及T3的影響

假手術(shù)組不毀損甲狀腺、手術(shù)組電凝毀損單側(cè)或雙側(cè)甲狀腺組織，2周后化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)大鼠血清TSH、fT4及T3水平。結(jié)果如表1所示，與假手術(shù)組比較，大鼠單側(cè)電凝毀損甲狀腺術(shù)后2周血清TSH水平輕度升高而T3、fT4則無顯著變化，符合亞臨床甲減癥的血清學(xué)特征;大鼠雙側(cè)電凝毀損甲狀腺2周后血清 T3、fT4顯著下降、TSH水平顯著升高，符合臨床甲減癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

表1 單側(cè)甲狀腺電凝毀損對(duì)大鼠血清TSH、T3及fT4的影響(s)Tab.1Effect of hemi-thyroid electrocoagulation on serum TSH，T3 and fT4 levels in the rats(s)

表1 單側(cè)甲狀腺電凝毀損對(duì)大鼠血清TSH、T3及fT4的影響(s)Tab.1Effect of hemi-thyroid electrocoagulation on serum TSH，T3 and fT4 levels in the rats(s)

注：*P ＜0.05，**P ＜0.01，與假手術(shù)組比較。Note：*P ＜0.05，**P ＜0.01，compared with the sham group.

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2.3 單側(cè)甲狀腺電凝毀損對(duì)大鼠甲狀腺形態(tài)學(xué)的影響

如圖2(彩插5)所示，假手術(shù)組大鼠甲狀腺濾泡上皮多數(shù)為單層立方上皮，有的濾泡出現(xiàn)單個(gè)局灶增生斑、實(shí)心芽、實(shí)心繼發(fā)濾泡。亞臨床甲減癥組大鼠甲狀腺濾泡上皮多數(shù)為單層立方上皮，但同時(shí)存在甲狀腺濾泡上皮增生現(xiàn)象，表現(xiàn)為上皮由單層變?yōu)閺?fù)層、細(xì)胞核體積增大、增生斑和實(shí)心芽較對(duì)照組明顯增加。提示，單側(cè)甲狀腺電凝毀損可導(dǎo)致對(duì)側(cè)甲狀腺輕度代償性增生。

3 討論

建立病理生理機(jī)制上更接近于人類的動(dòng)物模型是研究人類疾病形成和發(fā)展過程的基礎(chǔ)。然而，有關(guān)亞臨床甲減癥動(dòng)物模型的報(bào)道目前還較少，且模型建立方法并不理想。已報(bào)道的建立亞臨床甲減癥動(dòng)物模型的方法通常有兩種：一種是服用抗甲狀腺藥物(主要是丙基硫氧嘧啶)，另一種則是在手術(shù)切除甲狀腺后補(bǔ)充L-T4。然而，抗甲狀腺藥物本身就對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育存在影響［16］，手術(shù)切除甲狀腺后補(bǔ)充LT4從病程上則更類似于臨床甲減治療不充分，而且由于甲狀腺的解剖特點(diǎn)，手術(shù)切除導(dǎo)致的出血、喉上神經(jīng)及喉返神經(jīng)損傷等并發(fā)癥也限制了這一方法的普遍推廣，因而均不夠理想。

本課題組查閱大量文獻(xiàn)并結(jié)合亞臨床甲減癥的病理生理機(jī)制［7，8］，采用單側(cè)甲狀腺電凝毀損的方法建立了大鼠亞甲減模型。結(jié)果表明，單側(cè)甲狀腺電凝毀損術(shù)的Wistar大鼠手術(shù)后2周血清TSH水平較假手術(shù)組升高(P＜0.01)，而 fT4和T3水平則與假手術(shù)組差異無顯著性。若以TSH高于假手術(shù)組的第97.5百分位、fT4位于假手術(shù)組的第2.5與第97.5百分位之間作為亞甲減的診斷依據(jù)，則造模成功率為66.6%。而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中大鼠無出血、聲音嘶啞及誤咽等并發(fā)癥發(fā)生。病理形態(tài)學(xué)結(jié)果也顯示，單側(cè)甲狀腺電凝毀損術(shù)大鼠對(duì)側(cè)甲狀腺組織輕度增生，考慮為機(jī)體的代償作用，這就為亞臨床甲減癥大鼠血清TSH升高而fT4和T3與假手術(shù)組比較無顯著性差異提供了合理解釋。

本研究結(jié)果提示，單側(cè)甲狀腺電凝毀損建立大鼠亞臨床甲減癥模型是一種簡(jiǎn)便易行的造模方法，其結(jié)果可信、耗時(shí)不多。因此，本模型值得推廣，可用于亞臨床甲減癥的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)而為其病因及發(fā)病機(jī)制研究、治療及新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

(本文圖2見彩插5。)

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Establishment of a rat model of subclinical hypothyroidism by hemi-thyroid electrocoagulation

GE Jin-fang，ZHAO Bin，PENG Lei，WU Ting-ni，XIE Xue-feng，HU Cheng-mu
(School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Objective To investigate the feasibility of hemi-thyroid electrocoagulation in the establishment of a rat model of subclinical hypothyroidism(SCH).Methods Thirty-six young Wistar rats were randomly divided into three groups including sham，subclinical hypothyroidism，and clinical hypothyroidism(CH)groups.The rats in SCH group were given hemi-thyroid electriocoagulation，rats in CH group were given total thyroid electrocoagulation，while rats in the sham group only exposed thyroid without electrocoagulation.2 weeks after operation，blood samples of all rats were collected and serum thyrotropic-stimulating hormone(TSH)，free thyroxine(fT4)，and triiodothyronine(T3)were detected by chemoluminescence，while the thyroid tissue specimens were examined by histopathology using hematoxylin and eosin(HE)staining.Results Compared with the sham group，the weight of rats in CH group decreased，while there was no significant difference between the SCH group and sham group.The TSH level in both SCH and CH groups was significantly increased，the serum fT4 and thiiodothyronine T3 level of CH rats decreased significantly，while there was no significant difference between the SCH group and sham group.The pathology revealed slight hyperplasia in the contralateral thyroid of SCH rats.Conclusions The establishment of SCH rat model by hemi-thyroid electrocoagulation is simple and convenient for longitudinal study on the mechanism of initiation and progress of subclinical hypothyroidism.

Thyroid;Rat;Subclinical hypothyroidism(SCH);Model;Electrocoagulation

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0056-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.013

亞臨床甲狀腺功能減退癥(亞臨床甲減癥，subclinical hypothyroidism，SCH)，又稱輕度甲狀腺功能衰竭(mild thyroid failure，MTF)，是臨床甲狀腺功能減退癥(clinical hypothyroidism，CH)發(fā)展的早期階段，其特征為血清甲狀腺素(thyroxine，tetraiodothyronine，T4)、游離甲狀腺素(free thyroxine，fT4)、三碘甲腺原氨酸(，T3)、游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine，fT3)水平正常、但促甲狀腺激素(thyrotropic-stimulating hormone，TSH)水平高于正常值上限，患者通常不具有明顯甲狀腺功能減退的癥狀和體征［1，2］。流行病學(xué)顯示亞臨床甲減癥的患病率較高，社區(qū)調(diào)查的患病率為3% ～15%不等，每年約有2% ～5%的亞臨床甲減癥患者進(jìn)展為臨床甲減［1-4］。

安徽省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2010A185)。

葛金芳(1975-)，女，研究方向：分子藥理學(xué)。E-mail：aygjf@mail.ustc.edu.cn

2010-07-01