應用微衛(wèi)星標記研究Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

應用微衛(wèi)星標記研究Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景

朱 亮，蔡月琴，屠 玨，應華忠，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的 檢測我國現有Dunkin Hartley豚鼠封閉的遺傳背景，分析評估其遺傳多樣性水平和遺傳分離情況，為建立標準化的豚鼠封閉群監(jiān)測方法提供基礎資料。方法 應用篩選獲得的8個微衛(wèi)星位點，從一個數量為1000的豚鼠封閉群中隨機選擇72個個體，通過PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，進行等位基因檢測。并根據檢測結果分析評估了該豚鼠封閉群的遺傳現狀。結果 共檢測到28個等位基因，每個座位的等位基因數為2～5個，有效等位基因數為1.5191～3.4422，平均2.3093。平均期望雜合度為0.5294。各位點多態(tài)信息含量在0.3154～0.6545之間，平均值為0.4687。有5個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。結論 豚鼠封閉群的遺傳多態(tài)性處于中等水平，遺傳平衡檢測結果提示種群的繁殖過程未能實現完全隨機交配，近交現象一定程度上存在。本研究的結果將為豚鼠封閉群遺傳監(jiān)測方法和標準的建立提供基礎。

豚鼠;封閉群;微衛(wèi)星標記;遺傳多樣性

浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心豚鼠繁殖中心于1998年引進Dunkin Hartley豚鼠封閉群，飼養(yǎng)保種至今，已形成1000個個體的種群。中心研究人員通過磁珠富集法篩選獲得了17個豚鼠微衛(wèi)星位點［1］。本研究將以這些位點為工具，對Dunkin Hartley豚鼠封閉群進行微衛(wèi)星位點檢測，以期獲得現有實驗豚鼠種群的遺傳概貌信息，并從分子遺傳角度對現有繁育方式做出評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器

Dunkin Hartley豚鼠72只，從浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心豚鼠繁殖中心飼養(yǎng)的封閉群中隨機抽?。跾CXK(浙)2008-0037］。PCR相關試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳相關試劑購自上海生工生物工程有限公司。PTC-200 PCR擴增儀(Bio-Rad);水平電泳系統(tǒng)和垂直電泳系統(tǒng)(GE);凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

1.2 基因組的提取

取豚鼠新鮮肌肉組織(0.3～0.5)cm3，在 1.5 mL離心管中用消毒后的剪刀剪成小碎塊。然后參照《分子克隆實驗指南》方法提取基因組DNA［2］。

1.3 引物的選擇及篩選

通過預實驗，從已有的17個豚鼠微衛(wèi)星位點中篩選出8個多態(tài)性好的位點(表1)進行本實驗。所有引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.4 PCR擴增

10 μL 反應體系：1 μL 模板 DNA(10 ～30 ng)，0.5 U Taq DNA 聚合酶，1 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL MgCl2(25 mmol/L) ，0.75 μL dNTPs(20 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各 0.1 μL。反應條件如下：94℃預變性3 min;94℃變性30 s，每對引物的最佳退火溫度(表 1)退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán);然后72℃延伸10 min。

1.5 等位基因的分離

從擴增產物中取2 μL在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并根據檢測結果調整產物濃度。利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR擴增產物進行等位基因分離。電泳條件：恒壓250 V，0.5×TBE緩沖液中電泳3～4 h。經 Gelred染色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。然后對等位基因電泳圖譜進行分析。

1.6 數據統(tǒng)計分析

在 Cervus 3.0遺傳分析軟件上［3］，根據 Bostein等的公式［4］，計算微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC); 根 據Chakraborty的公式，分別計算單位點非父排除概率(exclusion probability，PE)和多位點非父累積排除概率 (cumulative exclusion probability，CPE)。根 據Fisher的公式［5］：DPi=1 －，計算單位點個體識別率(discrimination power，DP)，n表示某位點的基因型數，Pi表示該位點第i個基因型的頻率;根據公式：CDP=1－(1－DPi)，計算多位點累積個體識別率(cumulative DP)，其中，m表示微衛(wèi)星位點數，DPi表示第 i個位點的個體識別率。評估本研究使用的微衛(wèi)星位點的質量及其反映群體遺傳水平的有效性。

使用 POPGENE version 1.32 軟件［6］統(tǒng)計計算各個微衛(wèi)星位點在豚鼠群體中的觀察等位基因數(number of alleles per locus，Na)、有效等位基因數(number of effective alleles，Ne)、觀察雜合度 (observed heterozygosity，Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity，He)等指標。從而評估各微衛(wèi)星位點及豚鼠群體的遺傳多樣性。

使用GENEPOP軟件對各位點進行連鎖分析，根據位點等位基因的數目多少，應用完全計數或馬爾科夫鏈法檢驗群體的Hardy-Weinberg遺傳平衡狀態(tài)，同時計算Fis值用于評估群體的近交程度。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星擴增結果及多態(tài)性

8個微衛(wèi)星位點均呈現出多態(tài)性，共檢測到28個等位基因，各等位基因片段大小在149～349 bp之間。每個座位的等位基因數在2～5個之間，平均等位基因數3.5個。各基因位點的有效等位基因數為1.5191～3.4422不等，平均為2.3093個。等位基因最多的座位是 Cpo8，有5個等位基因;等位基因最少的座位是Cpo6，有2個等位基因?；蛐头N類最多的位點是 Cpo8，檢測到9種基因型;位點Cpo6顯示的基因型只有2種，是所有位點中最少的。各個基因位點的等位基因數、等位基因頻率和有效等位基因數的統(tǒng)計結果見表2。

2.2 群體遺傳多樣性分析

利用POPGENE version 1.32計算出各座位的觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)信息含量等指標，評估位點及群體的遺傳多樣性，結果見表3。各個基因位點的觀察雜合度在0.2222～0.5833之間，群體平均值為0.4531;期望雜合度在0.3441～0.7159之間，群體平均值為0.5294;8個位點的多態(tài)信息含量數值在0.3154～0.6545之間波動，群體平均值為0.4687。期望雜合度和多態(tài)信息含量最低的座位是Cpo3，分別為0.3441和0.3154;最高的座位是 Cpo11，分別為0.7159和0.6545。這8個位點的個體識別率從0.5403至0.8606不等，累積個體識別率達到了1.0000;各位點非父排除概率1在0.0584～0.2833之間，八位點累積值為0.7570;各位點非父排除概率2在0.1728～0.4519之間，八位點累積值為0.9415。

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

采用 Fisher＇s 精確檢驗(Fisher＇s exact test)或馬可夫鏈模型計算豚鼠群體每個微衛(wèi)星位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的精確 P值，并計算相應的Fis值［Fis(W＆C)］。結果顯示(表 3)，在本研究檢測的一共 8個位點中，有 5個位點(Cpo2、Cpo4、Cpo6、Cpo8、Cpo11)顯著偏離了 Hardy-Weinberg 平衡。在5個偏離 Hardy-Weinberg平衡的位點中，有4 個位點(Cpo2、Cpo4、Cpo8、Cpo11)的 Fis值為正值。以上結果提示本研究檢驗的豚鼠群體存在雜合子缺失的現象。

表1 8個豚鼠微衛(wèi)星位點和相關信息Tab.1 Charecteristics of eight microsatellite loci from guinea pig(Cavia porcellus)

表2 豚鼠封閉群在8個微衛(wèi)星位點上的等位基因信息Tab.2 Allele information at 8 microsatellite loci of guinea pig outbred colony

表3 豚鼠封閉群在8個微衛(wèi)星位點上的遺傳多態(tài)性Tab.3 The genetic diversity measured at 8 microsatellite loci of guinea pig outbred colony

3 討論

3.1 微衛(wèi)星標記在實驗動物封閉群遺傳檢測中的應用價值

作為一大類常用的實驗動物，封閉群動物在遺傳學上有顯著的特點。封閉群個體的遺傳結構呈雜合性，在同一基因位點上包含更多的等位基因，即具有更高的基因多態(tài)性。封閉群動物的遺傳背景一般通過等位基因個數、等位基因頻率和基因型頻率來體現。要獲得以上參數的準確數值，需要一個合適的遺傳檢測工具。該遺傳檢測工具要能夠檢測多位點并體現各位點的高多態(tài)性。而目前常用的實驗動物遺傳檢測方法是以生化標記檢測為主的表型檢測方法，主要針對近交系動物。其檢測位點較少體現多態(tài)性差，不適合于遺傳多態(tài)性高的封閉群動物，無法反映封閉群動物種群真實的遺傳概貌。而微衛(wèi)星標記具有以下特點：①分布廣，覆蓋整個基因組;②數量多，揭示的多態(tài)性高;③呈現多等位基因的特性，提供的信息量大;④引物通用、容易擴增。以上特點使微衛(wèi)星標記很適合用于封閉群動物的遺傳檢測。

本研究利用8個微衛(wèi)星標記，采用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳分型技術對一個Dunkin Hartley豚鼠封閉群的遺傳背景進行了檢測。涉及的8個微衛(wèi)星位點的多態(tài)信息含量(PIC)從0.3154至0.6545不等。多態(tài)信息含量(PIC)是根據 Botstein et al(1980)提出的公式計算出來的，它是衡量微衛(wèi)星DNA座位變異程度高低的指標。當微衛(wèi)星座位的PIC＞0.5時，為高度多態(tài)座位;當0.5＞PIC＞0.25時，為中度多態(tài)座位;當PIC＜0.25時，為低度多態(tài)座位。本研究涉及的8個豚鼠微衛(wèi)星位點中，3個為高度多態(tài)位點，5個為中度多態(tài)位點，平均多態(tài)信息含量為0.467。同時，這8個位點的個體識別率從0.5403至0.8606不等，累積個體識別率達到了1.0000;其累積非父排除概率1和累積非父排除概率2分別達到了0.7570和0.9415。以上結果表明本研究使用的8個微衛(wèi)星位點能夠提供充足的遺傳多樣性信息，可以滿足封閉群動物遺傳背景檢測的要求，同時還可以作為動物個體間親緣關系檢測及新品系培育等工作的有力輔助工具。

3.2 豚鼠封閉群的遺傳多樣性

每個位點等位基因的數目及全部位點等位基因的平均數是表征遺傳多態(tài)性的重要參數。有效等位基因數是基因純合度的倒數，反映了等位基因的相互影響，也可作為群體遺傳變異的一個指標［7］。本研究各座位等位基因數在2～5個之間，平均3.5個，各位點有效等位基因平均2.3093。

觀察雜合度和期望雜合度都是群體遺傳多樣性的反映。前者反映的是群體中實際的雜合比例，容易受樣本大小等因素的影響。而期望雜合度是假定各基因座位符合Hardy-Weinberg平衡而得到的雜合度，它受樣本取樣的影響較小，常被用來度量群體的遺傳多樣性，其高低可反映群體的遺傳一致性程度［7］，期望雜合度的數值越高，所在群體的遺傳多樣性就越豐富。本研究中各個微衛(wèi)星位點期望雜合度在0.3441～0.7159之間，群體平均值為0.5294。

由于豚鼠種群的遺傳多樣性水平目前還沒有報道，我們將本研究獲得的豚鼠種群遺傳多樣性指標與分類地位相近的實驗動物做了比較。昆明小鼠封閉群的平均等位基因數為6.1333，平均有效等位基因數為 3.1029，平均期望雜合度為 0.5721［8］;Wistar大鼠和SD大鼠的平均等位基因數為4.1667和4.3333，平均有效等位基因數為2.6717和2.5629，平均期望雜合度為 0.5982和 0.5859［9］;長爪沙鼠的平均等位基因數為2.6，平均有效等位基因數為2.1756［10］。日本大耳白兔、新西蘭兔和 WHBE兔的平均有效等位基因數分別為3.6077、2.6537和2.0402［11］。通過比較可見，本研究中 的 Dunkin Hartley豚鼠種群遺傳多樣性處于中等水平。

Fis是種群內個體之間的近交系數，它的取值范圍為-1至1。當Fis值為極顯著的正值時，表示群體內近交程度較嚴重;當Fis值為極顯著的負值時，群體內觀測雜合度大于期望雜合度，則表示群體內存在遠交［12］。本研究得到的 Fis值在 4個位點(Cpo2、Cpo4、Cpo8、Cpo11)為正值，說明該豚鼠種群內雜合體較少，提示群體內存在近交現象。

根據Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果，豚鼠種群在 5 個位點(Cpo2、Cpo4、Cpo6、Cpo8、Cpo11)偏離Hardy-Weinberg平衡，在3個位點處于遺傳平衡狀態(tài)(Cpo3、Cpo13、Cpo14)，大部分偏離遺傳平衡的位點都表現出雜合子缺失的現象。導致這一現象的原因除了無效等位基因之外，大部分的偏離可能是封閉群內存在近交導致的。同時，偏離遺傳平衡的位點相應的Fis值絕大多數為正值，也揭示了種群內存在一定程度近交的可能性。實驗動物封閉群Hardy-Weinberg平衡偏離現象在實驗動物繁育研究中常見報道的一個問題［13，14］。

封閉群動物個體的遺傳結構呈雜合性，而整個動物群體內全部雜合型基因的分布頻率，即遺傳組成在每一代保持穩(wěn)定性。雜合性有利于群體攜帶更多的基因，穩(wěn)定性則保證群體對實驗反應呈現最大的重復性［15］。如果隨機交配因素在種群內持續(xù)存在的話，會導致等位基因的丟失和種群基因頻率的改變，無法保持封閉群的遺傳特性，從而影響到試驗結果的可比性。以目前封閉群實驗動物的繁育過程中普遍缺乏相應的遺傳監(jiān)測的現狀來看，除了要遵守嚴格的繁育程序操作以避免近交現象，還有必要對封閉群進行定期的遺傳檢測，并且根據檢測結果評估和調整繁育方式。

本研究利用8個微衛(wèi)星標記，初步確定了豚鼠群體的遺傳概貌，揭示了豚鼠封閉種群的遺傳多樣性處于中等水平。同時，Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果提示種群的繁殖過程未能實現完全隨機交配，近交現象一定程度上存在。本研究的結果將為豚鼠封閉群遺傳監(jiān)測方法和標準的建立提供基礎。

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Assessment of the genetic background in Dunkin Hartley guinea pig outbred stock using microsatellite DNA markers

ZHU Liang，CAI Yue-qin，TU Jue，YING Hua-zhong，XU Jian-qin，CHEN Min-li
(Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China)

Objective To estimate the genetic diversity and genetic differentiation of a Dunkin Hartley guinea pig outbred stock and providing valuable information and references for standardization of the population.Methods A total of 72 samples from a Dunkin Hartley guinea outbred pig stock were genotyped using 8 microsatellite DNA markers by PCR-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.Genetic variation of the population was evaluated and Hardy-Weinberg equilibrium was tested for each locus.Results 28 alleles were found in the outbred stock，2-5 alleles each locus，and the effective number of alleles each locus ranged from 1.5191 to 3.4422，with an average of 2.3093.The average of unbiased expected heterozygosity was 0.5294.The polymorphic information content(PIC)ranged from 0.3154 to 0.6545，with an average of 0.4687.Five of 8 loci showed significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium(HWE).Conclusions The results indicate that the genetic diversity of the Dunkin Hartley guinea pig outbred stock is moderate.Inbreeding has some shortcomings in comparison with outbred stock.Genetic information provided by this reserch will be useful in developing genetic monitoring methods and standardization of the outbred guinea pigs.

Guinea pig;Outbred colony;Microsatellite mark;Genetic diversity

Q95-33，R394

A

1005-4847(2011)01-0051-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.012

豚鼠作為一種實驗動物被用于生物醫(yī)學研究已經有很長的歷史。目前，在速發(fā)型過敏性呼吸道疾病研究、各種抗結核病藥物的篩選、實驗性壞血病研究、聽覺和內耳疾病研究等方面，豚鼠都是最佳選擇。

Dunkin Hartley豚鼠是英國種豚鼠的白化封閉群，因為其生長快、抗病力強，繁殖性能好，是我國使用最廣泛的封閉群豚鼠。

浙江省科技廳實驗動物公共服務平臺項目(2008F80024)。

朱亮(1978-)，女，助理研究員，博士，研究方向：動物分子遺傳。E-mail：tozhuliang@126.com

2010-09-30