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    利用細(xì)莖石斛種子胚繁育試管苗的不同培養(yǎng)基研究△

    2011-09-27 11:40:46張倩倩劉守金俞年軍方成武
    中國現(xiàn)代中藥 2011年4期
    關(guān)鍵詞:原球莖壯苗長勢

    張倩倩,劉守金,俞年軍,方成武

    (安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室,安徽 合肥 230031)

    栽 培

    利用細(xì)莖石斛種子胚繁育試管苗的不同培養(yǎng)基研究△

    張倩倩,劉守金*,俞年軍,方成武

    (安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室,安徽 合肥 230031)

    目的:建立細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L.)Sw.種子胚的組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。方法:在相同的培養(yǎng)條件下,種子胚接種于8種不同培養(yǎng)基上,選擇長勢相近的試管苗轉(zhuǎn)接于添加不同濃度激素的1/2 MS培養(yǎng)基上,對不同生長狀況的試驗結(jié)果進行統(tǒng)計和分析。結(jié)果:比較適合誘導(dǎo)細(xì)莖石斛種子萌發(fā)的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA,生根的培養(yǎng)基是1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA,壯苗的培養(yǎng)基1/2 MS+1.2 mg·L-1IBA。結(jié)論:適合的培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛種子胚的生長發(fā)育結(jié)果有很大差異。

    細(xì)莖石斛;組織培養(yǎng);種子胚

    細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.又名銅皮石斛,為蘭科石斛屬多年生附生草本植物,以莖入藥,性寒,味甘,具有滋陰清熱、益胃生津、消炎止痛、增強免疫力等功效,歷來作為石斛品種來源之一。石斛屬植物主要分布于我國西南地區(qū),大別山區(qū)是該屬植物的分布北緣,也是藥用優(yōu)質(zhì)石斛的主要分布區(qū)域,細(xì)莖石斛是安徽大別山區(qū)野生變家種的品種之一。由于該種的生長與繁殖對環(huán)境要求嚴(yán)格,種子缺乏胚乳組織,僅有幾個細(xì)胞的不成熟胚,自然條件下萌發(fā)率極低[1],加上環(huán)境的破壞和人們對野生資源的掠奪性采挖,導(dǎo)致資源的嚴(yán)重匱乏。目前石斛的低繁殖率是制約規(guī)?;a(chǎn)的關(guān)鍵問題。該屬植物通過組織培養(yǎng)進行繁殖有許多研究[2],細(xì)莖石斛以莖段為外植體、種子通過組織培養(yǎng)進行繁殖研究較少[3-5]。本試驗在已有的研究基礎(chǔ)上,對安徽霍山產(chǎn)的細(xì)莖石斛種子胚萌發(fā)及生根壯苗的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)基篩選研究,優(yōu)化培養(yǎng)條件,為細(xì)葉石斛的規(guī)?;a(chǎn)提供組培苗方面的研究試驗探索。

    1 材料

    細(xì)莖石斛的果實于2009年12月采自安徽霍山縣太平畈鄉(xiāng),原植物經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院劉守金教授鑒定為蘭科植物細(xì)莖石斛Dendrobiummoniliforme(L .)Sw.,憑證標(biāo)本ZH001存于安徽中醫(yī)學(xué)院標(biāo)本館(ACM)。

    2 方法

    2.1 種子胚萌發(fā)培養(yǎng)

    將細(xì)莖石斛的果實沖洗干凈,置0.1 %升汞試液中表面消毒8 min,無菌水沖洗3次,再用75 %乙醇浸泡1 min,無菌水沖洗3次;用無菌鑷子撕開果皮,輕輕抖動,把種子散落到加入無菌水的小燒杯中,使種子呈懸浮狀態(tài);用吸管吸取懸浮液,分別接種在1/2 MS、1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA、MS、MS+1.0 mg·L-1NAA、KC、KC+1 mg·L-1NAA、B5、B5+1.0 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上,每種培養(yǎng)基各10瓶,觀察100 d記錄。

    2.2 生根壯苗培養(yǎng)

    從細(xì)莖石斛種子胚培養(yǎng)出的幼苗中,選取高度、長勢相近,沒有生根的幼苗轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基中,分別加激素NAA濃度為0.5,1.0,1.5,2.0 mg·L-1;激素IBA濃度為0.1,0.4,0.8,1.2 mg·L-1的培養(yǎng)基上,每種10瓶,每瓶接種6個小苗,觀察90 d記錄。

    2.3 培養(yǎng)條件

    培養(yǎng)溫度25 ℃,前5 d為暗培養(yǎng),后期光照強度2 500 lx,光照時間10 h·d-1,濕度75 %。

    2.4 觀察記錄項目

    觀察種子萌發(fā)情況和在不同培養(yǎng)基上試管苗的長勢情況,包括轉(zhuǎn)綠時間、原球莖形成時間、形態(tài)分化時間、形成叢生芽的形態(tài)、平均苗高、苗壯度、葉色、葉長;平均根長、根數(shù)、根長勢、平均株高、叢生苗數(shù)、葉長/寬、葉色、健壯度。

    3 結(jié)果

    3.1 不同培養(yǎng)基配方對細(xì)莖石斛種子胚的萌發(fā)和原球莖分化的影響

    組織培養(yǎng)18 d后,1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中種子胚最先轉(zhuǎn)綠,1/2 MS、MS、MS+NAA、KC、KC+NAA、B5+NAA培養(yǎng)基中種子胚陸續(xù)轉(zhuǎn)綠,并逐漸膨大,B5培養(yǎng)基中種子未見萌發(fā)轉(zhuǎn)綠,見表1。

    35 d后,1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中形成原球莖,單個原球莖呈小圓錐狀,或多個呈桑椹狀,單個原球莖直徑達到0.6~0.8 cm。原球莖頂端有鱗片狀的葉原基突起,呈深綠色;MS、MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖較小,直徑最大達到0.4 cm,呈淡黃綠色。KC+NAA、KC培養(yǎng)基中原球莖直徑最大達到0.5 cm,呈翠綠色。B5+NAA培養(yǎng)基中原球莖小,直徑僅有0.2 cm。B5培養(yǎng)基中未形成原球莖,見表1。

    45 d后,1/2 MS+NAA培養(yǎng)基中原球莖大量分化,形成莖、芽,均粗壯,葉片多,顏色深,葉最長約1.0 cm,苗最高達到1.2 cm,長勢很好。KC和KC+NAA培養(yǎng)基中,苗大量叢生,成簇狀,但苗比1/2 MS和1/2 MS+NAA細(xì)小。MS、KC培養(yǎng)基中原球莖沒有分化,見表2。

    表1 不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛原球莖形成的影響

    表2 不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛幼苗發(fā)育的影響

    注:+-不發(fā)達;++ - 一般發(fā)達;+++ -較發(fā)達;++++ -最發(fā)達

    3.2 不同濃度的IBA激素對細(xì)莖石斛壯苗的影響

    觀察1/2 MS培養(yǎng)基中,加濃度分別為0.1,0.4,0.8,1.2 mg·L-1的激素IBA,平均株高、葉片長度/寬度逐漸增加,葉片顏色逐漸變深,苗逐漸粗壯。平均根長逐漸增長、根數(shù)增多,根由細(xì)、小長為粗、長。當(dāng)IBA激素濃度達到1.2 mg·L-1時,苗最健壯,見表3。

    表3 不同濃度的IBA激素對細(xì)莖石斛壯苗的影響

    注:+-不發(fā)達;++ - 一般發(fā)達;+++ -較發(fā)達;++++ -最發(fā)達

    3.3 不同濃度的NAA激素對細(xì)莖石斛生根的影響

    在1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度NAA組中,濃度為0.5 mg·L-1和1.5 mg·L-1的兩組植株均白化死亡。由表4觀察出,濃度為1.0 mg·L-1時,生根率達到了100 %,根長、粗、壯,并且叢生苗多,葉大、色深,苗長勢健壯。濃度為2.0 mg·L-1時,平均根長達到了1.2 cm,生根率為80 %,根粗、壯。叢生苗達到3個,葉大,但有很多黃葉。

    表4 不同濃度的NAA激素對細(xì)莖石斛生根的影響

    注:++ -一般發(fā)達;+++ -較發(fā)達

    4 結(jié)論與討論

    通過8種不同培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛種子萌發(fā)和分化影響的比較研究,結(jié)果表明,在1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基,種子胚培養(yǎng)約18 d種子開始變綠,并逐漸膨大;培養(yǎng)35 d后觀察,由種子形成的原球莖比較均勻,直徑在0.6~0.8 cm。其后原球莖上端開始有芽形成,45 d后觀察幼苗形成。1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基對細(xì)莖石斛的原球莖形成、分化時間最短,幼苗平均高達到了1.2 cm,莖粗、壯,葉最長1 cm,葉片多,顏色深,長勢最好。在KC+NAA培養(yǎng)基組中,種子胚通過培養(yǎng)產(chǎn)生大量簇生的幼苗,但苗較1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA培養(yǎng)基萌發(fā)的苗細(xì)小。試驗結(jié)果提示在同類培養(yǎng)基中,添加NAA激素組的種子萌發(fā)情況均好于不添加激素組。MS、B5和B5+NAA培養(yǎng)基均不適合細(xì)莖石斛的種子萌發(fā)。

    在比較1/2 MS培養(yǎng)基中添加不同濃度IBA對生根的影響中,當(dāng)激素IBA濃度為1.2 mg·L-1時,苗的長勢相對較好,生根率達到80 %,平均根數(shù)及平均根長均最好,1/2 MS +1.2 mg·L-1IBA是壯苗和生根的最適培養(yǎng)基。

    [1] 張明,夏鴻西,朱利泉,等.石斛組織培養(yǎng)研究進展[J].中國中藥雜志,2000,25,(6):323-326.

    [2] 明興加,馮婷婷.中國石斛屬植物種苗繁育技術(shù)的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(6):2899-2902,2920.

    [3] Choi SK, Lee DK. The study on the artificial propagation ofDendrogiummoniliformein wild medicinal herb[J]. The Research Reports of the Rural Development Administration,1989, 31(3): 52-56.

    [4] 王再花,涂紅艷,葉慶生.細(xì)莖石斛的快速繁殖和試管開花誘導(dǎo)[J].植物生理學(xué)通訊,2006,42(6):1143-1144.

    [5] 田雪琪,張鐵.細(xì)莖石斛組織培養(yǎng)研究[J].文山師范高等專科學(xué)校學(xué)報,2007,20(3):114-116.

    TissueCulturingandRapidPropagationofDendrobiummoniliforme(L.)Sw.

    ZHANG Qian-qian, LIU Shou-jin, YU Nian-jun, FANG Cheng-wu

    (SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,AnhuiKeyLaboratoryofModernTraditionalChineseMedicine,Hefei, 230031,China)

    Objective:To established the optimal medium and culture condition for in vitro culture and rapid propagation of embryo ofD.moniliforme.Methods: The embryo was inoculated and cultivated in 8 different kinds of culture medias under the same culture condition.The same length of seeding was inoculated in 1/2 MS solid medium with different concentrations of hormones (NNA and IBA).Results:1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for embryo germination,and 1/2 MS containing 1.0 mg·L-1NAA is the best media for the developing of roots;and 1/2 MS containing 1.2 mg·L-1IBA is the best media for plantlet strengthening.Conclusion: Tissue culture is effective way in the rapid propagation for large-scale production ofD.moniliforme.

    Dendrobiummoniliforme; Tissue culture; Embryo.

    安徽省自然基金項目(090413110),安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2010A203)

    *劉守金,Tel:(0551)5169306,E-mail:liushjin@hotmail.com

    2010-12-09)

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