釀酒酵母胞內(nèi)代謝關鍵酶對乙醇的耐受性

聶 妤, 董 亮, 侯 德 文, 李 明 達, 王 曉 丹, 趙 長 新

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034; 2.華潤雪花啤酒(盤錦)有限公司, 遼寧 盤錦 124010 )

0 引 言

酵母菌株對濃度較大的乙醇的耐受性存在明顯的差異[1],而其耐酒精的生化機理對于提高工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酒精和研究酵母抵抗不良環(huán)境生命機制有著重要的理論和實際意義,近幾年來科研工作者從自然界中分離得到或通過遺傳工程手段構建了一些能在短時間內(nèi)產(chǎn)生高濃度酒精(發(fā)酵液中的乙醇體積分數(shù)達到17.5%以上,而普通酵母菌只能產(chǎn)生9%～11%乙醇)的酵母菌,同時開展了大量的酵母菌耐酒精的生化機制的研究工作,發(fā)現(xiàn)酵母菌耐酒精的生理機理是十分復雜的[2-4]。細胞中的許多組分與酵母菌耐酒精能力有密切的關系,并且細胞的許多基因控制著酵母菌耐酒精的特性,而且這些具體生化機理還有待于進一步研究[5-6]。

本文以酶學研究為切入點,通過對不同酒精體積分數(shù)下的酵母細胞糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中關鍵代謝節(jié)點處的關鍵酶進行分析,關鍵酶活力的變化一定程度上反映了其對酒精的耐受能力,為酵母對酒精耐受的生化機理研究提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeFCC 2146,由大連工業(yè)大學生物與食品學院保藏所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(100 mL):蛋白胨2 g,葡萄糖2 g,酵母提取粉1 g,pH 6.0,0.1 MPa,115 ℃,滅菌20 min。

供試培養(yǎng)基是在此培養(yǎng)基中添加一定量的乙醇。

①YPD對照；②YPD+2 mL乙醇；③YPD+4 mL乙醇；④YPD+6 mL乙醇；⑤YPD+8 mL乙醇。

1.1.3 儀 器

TGL-16G臺式離心機,上海安亭科學儀器廠；B-22M超高速冷凍離心機,Thermo IEC公司；全溫落地式搖床,上海精宏儀器設備有限公司；JY99-2D超聲波細胞粉碎機,寧波新芝科器研究所。

1.2 方 法

1.2.1 酵母培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng):按體積分數(shù)2%的接種量接種于上述①、②、③號培養(yǎng)基中,在500 mL錐形瓶裝液150 mL,30 ℃、230 r/min下在往復式振蕩搖床培養(yǎng)24 h。定時無菌操作取10 mL發(fā)酵液維素酯濾膜進行真空超濾用于分析。

種子培養(yǎng):菌種復壯后,挑取1菌環(huán)酵母置于含有50 mL無菌YNB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,在30 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h,制備正處于指數(shù)生長期的細胞懸濁液。

1.2.2 酶活力檢測

在YPD培養(yǎng)基中添加乙醇體積分數(shù)分別為2%、4%、6%、8%。接入S.cerevisiae連續(xù)培養(yǎng),在它們各自的對數(shù)期取樣,測定中間代謝途徑中的一些關鍵酶活性隨乙醇的變化,并繪制變化曲線。包括磷酸戊糖途徑(6-磷酸葡萄糖脫氫酶,G6PDH),糖酵解途徑(丙酮酸激酶,PYK),檸檬酸循環(huán)(蘋果酸脫氫酶,MDH；異檸檬酸脫氫酶,ICDH；異檸檬酸裂解酶,ICL)以及乙醇脫氫酶YADH活性。丙酮酸激酶按參考文獻[7]的方法測定,異檸檬酸脫氫酶按參考文獻[8]的方法測定,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶按參考文獻[9]的方法測定,蘋果酸脫氫酶按參考文獻[10]的方法測定,乙醇脫氫按酶參考文獻[11]的方法測定。酶活力單位的定義為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)轉化1 μmol底物所需要的酶量為1個活力單位(U)。

2 結果與討論

2.1 丙酮酸激酶對乙醇的耐受性分析

由圖1可以看出,丙酮酸激酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而減小。在不添加乙醇條件下,酵母細胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最高為0.682 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最低為0.022 U。而在乙醇體積分數(shù)2%時,酵母細胞內(nèi)丙酮酸激酶活力為0.152 U,較無乙醇的酶活力降低了77.7%。說明丙酮酸激酶活力對乙醇體積分數(shù)變化較為敏感,耐受性比較差。PYK活性提高有利于糖酵解途徑進行的順利,反之該酶活性降低會導致細胞能量的供應受到影響。它在細胞內(nèi)含量的多少反映了細胞內(nèi)流經(jīng)糖酵解途徑的通量大小。

圖1 丙酮酸激酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶對乙醇的耐受性分析

由圖2可見,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而略有增加。在無乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最低為0.148 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)丙酮酸激酶活力最高,為0.183 U,較無乙醇條件下酶活力提高了23.65%,由此可知,乙醇體積分數(shù)的增加對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力的影響較小,耐受性較強。綜上說明,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,酵母細胞內(nèi)的PP途徑也相應地增大,以提供大量的NADPH還原力以減輕乙醇對細胞的毒害作用。

圖2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

2.3 蘋果酸脫氫酶對乙醇的耐受性分析

由圖3可見,蘋果酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而增加。在無乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細胞內(nèi)蘋果酸脫氫酶活力最低為0.032 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)蘋果酸脫氫酶活力最高為0.114 U,較無乙醇條件下酶活力提高了256.25%。從圖3中可以看出,當乙醇體積分數(shù)高于4%時,蘋果酸脫氫酶活力升高較為顯著,由0.045 U升高至0.106 U。由此可知,乙醇體積分數(shù)的增加能夠增加蘋果酸脫氫酶的活力,蘋果酸脫氫酶對乙醇的耐受性較強,當胞外乙醇體積分數(shù)超過4%時,蘋果酸脫氫酶活力較高,TCA循環(huán)中該酶所催化的代謝反應較為活躍。

圖3 蘋果酸脫氫酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

2.4 異檸檬酸脫氫酶對乙醇的耐受性分析

由圖4可見,異檸檬酸脫氫酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而減小。在無乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細胞內(nèi)異檸檬酸脫氫酶活力最高,為0.201 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)異檸檬酸脫氫酶活力最低,為0.003 U。說明異檸檬酸脫氫酶活力對于乙醇體積分數(shù)較為敏感,耐受性比較差。由此可知,在外源乙醇體積分數(shù)較高的情況下,異檸檬酸脫氫酶活力很低,說明異檸檬酸并不是由異檸檬酸脫氫酶催化生成α-酮戊二酸,而很可能是由異檸檬酸裂解酶將其催化生成琥珀酸和乙醛酸。

圖4 異檸檬酸脫氫酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

2.5 異檸檬酸裂解酶對乙醇的耐受性分析

由圖5可見,異檸檬酸裂解酶活力隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大。在無乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細胞內(nèi)的異檸檬酸裂解酶活力最低,為0.302 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)異檸檬酸裂解酶活力最高,為1.136 U,較無乙醇條件下酶活力提高了276.16%。由圖5可知,乙醇體積分數(shù)的增大能夠使異檸檬酸裂解酶活力增大,外源乙醇的添加對異檸檬酸裂解酶活力有一定的促進作用。這與“2.4”所做出的推斷相符。

圖5 異檸檬酸裂解酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

說明異檸檬酸在TCA循環(huán)中的去路主要是通過異檸檬酸裂解酶轉化而成乙醛酸和琥珀酸,這種轉變是由外源乙醇體積分數(shù)的增大所引起的。

2.6 乙醇脫氫酶對乙醇的耐受性分析

由圖6可見,乙醇脫氫酶活力隨著乙醇體積分數(shù)的增加而減小。在無乙醇添加的培養(yǎng)條件下,酵母細胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力最高,為3.779 U；在乙醇體積分數(shù)8%時,酵母細胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力最低為0.467 U。而在乙醇體積分數(shù)2%時,酵母細胞內(nèi)乙醇脫氫酶活力為1.409 U,較無乙醇添加條件下的酶活力降低了62.72%。說明乙醇脫氫酶活力對于乙醇較為敏感,耐受性比較差,較低體積分數(shù)的乙醇對其活性產(chǎn)生較大的抑制作用。乙醇脫氫酶的酶活高,可以快速地將碳源轉化為乙醇,減少代謝中間產(chǎn)物丙酮酸在其他代謝途徑上的代謝通量。而過量乙醇的反饋抑制使乙醇脫氫酶的酶活降低,不能及時地將丙酮酸轉化為乙醇,導致代謝中間產(chǎn)物丙酮酸積累,使丙酮酸流向乙醛途徑和乳酸途徑等。

圖6 乙醇脫氫酶活力隨乙醇體積分數(shù)變化曲線

3 結 論

分別考查了乙醇體積分數(shù)2%、4%、6%、8%時的酵母細胞糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、異檸檬酸裂解酶活力等關鍵代謝節(jié)點處的酶活力,實驗發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酒精的耐受能力較強,酶活力隨乙醇體積分數(shù)的升高變化不大；丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶和乙醇脫氫酶表現(xiàn)出對酒精的耐受力較差,其酶活力隨乙醇體積分數(shù)的升高而降低；蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸裂解酶表現(xiàn)出對酒精良好的耐受性,其酶活力變化隨乙醇體積分數(shù)的升高而增大。研究同時發(fā)現(xiàn),由于在乙醇體積分數(shù)較高時,異檸檬酸脫氫酶活力的降低及異檸檬酸裂解酶活力的大幅度提高,導致酵母細胞的能量代謝途徑發(fā)生變化,TCA循環(huán)被抑制,異檸檬酸在TCA循環(huán)中主要是通過異檸檬酸裂解酶轉化而成乙醛酸和琥珀酸,后通過乙醛酸循環(huán)的回補途徑。

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