甘氨酸氮源對大腸桿菌代謝的影響

許 衛(wèi) 萍, 田 晶

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

微生物代謝組學力求全面地定性和定量細菌細胞內所有的低分子質量(<1 000)的代謝物,該技術可通過考察生物體系受到刺激或擾動(如某一特定的基因變異或環(huán)境變化)后,其代謝產物的波動或其隨時間的變化規(guī)律來研究生物體系的代謝表型改變[1-2],目前已廣泛應用于微生物的生理研究[3]。作者首先利用GC-MS分析E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)兩株菌在甘氨酸為氮源條件下的代謝指紋,然后通過多變量數據處理,找到在兩株菌細胞內濃度差異較大的化合物,繼而分析并解釋氮源差異對菌株代謝特別是氨基酸代謝的影響。

1 實 驗

1.1 菌 株

E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)由中國科學院大連化學物理研究所提供。

1.2 儀器和試劑

儀器:GC-MS QP2010,日本Shimazu公司；超低溫冰箱NU-6518E,NUAIRE -86 ℃ Ultralow Freezer；真空冷凍干燥機FREEZONE4.5,美國Labconco公司；Biofuge stratos高速冷凍離心機,德國Kendro公司。

試劑:癸酸,吡啶,有機酸,氨基酸,N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA+1%TMCS)均購于SIGMA公司；甲醇、氯仿、乙腈(HPLC級)購于Tedia。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉湯19.8 g/L。

全合成培養(yǎng)基(mg/L):組成見文獻[4]。

1.3.2 培養(yǎng)條件

兩株菌在LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng):35 ℃,160 r/min的通氣恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)12 h；取活化后的菌液1%,5 mL生理鹽水洗菌體2次,轉接入全合成培養(yǎng)基中,250 mL三角瓶裝液量為100 mL,在35 ℃、160 r/min的通氣恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)12 h。每株菌平行培養(yǎng)6次共產生12個樣品。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞干重及菌體生長的光密度測定

取5 mL菌液離心所得沉淀,用生理鹽水洗凈后在60～100 ℃的烘箱中烘干5 h,稱重至恒重(g),細胞質量濃度(g/L)為(m×1 000)/V,菌體的生長情況可以用600 nm下的光密度(OD600)來表示。細胞干重按照文獻[5]的方法計算。

1.4.2 樣品淬滅和提取

淬滅方法選擇冷乙腈淬滅法:取3 mL對數生長期[6]的菌液加入到12 mL冷乙腈中,放入-80 ℃冰箱中淬滅15 min,在4 ℃低溫下,10 000g離心10 min,棄去上清液。

提取方法選擇甲醇/氯仿提取方法,1.5 mL甲醇和0.75 mL去離子水分別加入每個樣品中,同時加入100 μL 0.3 mg/mL的內標癸酸。渦旋1 min后,每個樣品加1.5 mL氯仿,在4 ℃條件下靜置10 min, 然后離心分層,取甲醇/水層1 mL冷凍干燥[7]。

1.4.3 衍生方法

在凍干后的胞內代謝物中加入50 μL吡啶,超聲(480 W)10 min溶解后,再加入60 μL BSTFA+1%TMCS,75 ℃水浴45 min。10 000g離心10 min后取上清用于GC-MS分析。BSTFA+1%TMCS衍生試劑是用三甲基硅烷基團(+72)取代—COOH、—NH2、—SH、—SO2H和—OH上的活潑氫,使不揮發(fā)的化合物能夠在氣相色譜上檢測出來。

1.4.4 GC-MS分析方法

色譜柱:DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣1 μL；分流比10∶1；70 ℃ (5 min)―5 ℃/min―280 ℃ (5 min)；載氣體積流量He 1.5 mL/min；MS:進樣口280 ℃,離子源200 ℃,傳輸線280 ℃,離子掃描:40～600m/z;溶劑延遲5 min;檢測電壓1 400 V。

1.4.5 數據處理

生成峰表:包括峰號、保留時間、峰面積的峰表由工作站自動積分生成,積分斜率100,最小峰面積10 000。用內標癸酸歸一化后輸入SIMCA-P軟件(Umea,瑞典)中進行模式識別分析,首先使用PCA進行表型區(qū)分,再使用PLS-DA方法尋找代謝差異,并用VIP(variable importance in the projection)和“S-plot”篩選潛在標記物。

1.4.6 代謝物定性

實驗使用NIST庫(National Institute of Standards and Technology)作為定性的標準譜庫,定性過程由儀器工作站完成。定性信息如相似度、CAS號和化合物名稱列于峰表內。相似度大于75的化合物認為定性結果可靠,部分化合物由標樣驗證。

2 結果與討論

2.1 兩株菌生長曲線比較

圖1為采用比濁法測定E.coli的野生型菌株Y1.1566及其琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)的生長曲線。由圖1可知,在氮源限制培養(yǎng)條件下,與野生型菌株Y1.1566相比琥珀酸脫氫酶基因缺失突變株ΔsdhAB(S)具有顯著的不同。ΔsdhAB(S)的生物量明顯低于Y1.156 6,由此可知,敲除ΔsdhAB(S)對于菌株生長較為不利[5]。

圖1 兩株菌的生長曲線

2.2 兩株菌代謝差異分析

利用有監(jiān)督模型識別方法PLS-DA對兩株菌代謝差異進行分析,并找出在分類中起重要作用的潛在變量。對于PLS-DA模型一般認為R2Y(分類信息解釋能力)至少大于0.5,同時R2Y和Q2(預測率)之間差在0.2～0.3。由圖2可以看出,R2Y為0.995,Q2為0.967說明模型有很好的預測能力并對分類信息解釋能力較強,能很好地將兩類樣品分開。

圖2 Y1.1566和ΔsdhAB在氮源限制培養(yǎng)條件下的PLS-DA模型

2.3 潛在標記物的選擇

PLS-DA模型中一般認為VIP大于1的變量均可認為是潛在標記物。在將潛在標記物與生物學信息相關聯前,需對潛在標記物進行篩選。PLS-DA模型VIP大于1的共有132個代謝物,大于2的共有30個[圖3(a)]。在S-plot上,有14個代謝物位于“S”兩端[圖3(b)],這意味著它們對分類貢獻度和可靠性較高,因此被確定為潛在標記物,最后經過t檢驗篩選出8個顯著性高的化合物(表1)。

結合圖3(a)、3(b)及表1可以看出,一些胞內代謝物濃度在兩株菌中發(fā)生了變化。VIP最大為吡喃葡萄糖苷,其次為葡萄糖醇和甘氨酸。雖然琥珀酸脫氫酶被敲除,但琥珀酸濃度變化對兩株菌代謝區(qū)分的貢獻只占很小一部分(VIP=1.88)。這也間接說明了一個較普遍的現象:從代謝物水平看,遺傳改造的靶點往往不是直接受到最大影響之所在。在氮源限制條件下,E.coli野生型與敲除琥珀酸脫氫酶基因型菌株的生長由于遺傳的改變,其生長狀態(tài)及體內代謝都受到影響。而對于敲除琥珀酸脫氫酶基因型的S菌,雖然琥珀酸在體內得到積累,但并不是變化最顯著的化合物。琥珀酸作為TCA的中間代謝產物,在有氧環(huán)境下,不會過多積累,這與文獻[8]報道的結果是一致的。

圖3 多變量統(tǒng)計分析結果

由于本研究所用培養(yǎng)基為甘氨酸氮源,因此又著重對細胞內氨基酸之間的變化進行了分析。對所鑒定的氨基酸之間相關系數具有顯著性(p<0.05)的化合物,構建網絡圖見圖4。從圖4中可以看出敲基因(a)和野生型(b)株中,脯氨酸、異亮氨酸與谷氨酰胺之間的關系發(fā)生的變化最明顯。

3 結 論

氮源限制條件下,E.coli敲基因型菌株由于琥珀酸脫氫酶的敲除,導致細胞內諸多代謝物濃度發(fā)生變化,尤其是調節(jié)高滲狀態(tài)生長特性的氨基酸發(fā)生變化,生長曲線反映了S株生長受到抑制。本研究也說明單個基因的改變引起的代謝變化是比較廣泛的。

圖4 細胞內主要氨基酸代謝物相關分析

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