紫杉醇分子印跡聚合物的制備及其吸附性能

朱 林 敏, 朱 文 佳, 周 鋒 偉, 劉 麗 雙, 付 紹 平, 朱 靖 博

(大連工業(yè)大學 植物資源化學與應用研究所, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

紫杉醇是從太平洋短葉紅豆杉樹皮中分離到的一種具有抗癌活性的四環(huán)二萜化合物[1]。紫杉醇以其獨特的抗癌機理得到廣泛的應用,目前已作為乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的臨床一線用藥[2]。迄今,紫杉醇主要從紅豆杉屬植物的莖皮中分離獲得,但樹皮中紫杉醇的含量僅有0.01%左右[3],因此研究高選擇性和穩(wěn)定性好的吸附材料用于紫杉醇的富集分離具有十分重要的意義。分子印跡技術是模仿天然抗原-抗體反應原理,制備對某一特定分子(模板分子)具有分子識別性能的分子印跡聚合物的技術[4]。分子印跡聚合物兼?zhèn)淞松镒R別體系和化學識別體系的優(yōu)點,具有選擇性高、制備簡單、穩(wěn)定性好、機械強度高、對環(huán)境耐受性好等特點[5],可選擇性識別富集復雜樣品中的目標物。因此,MIP被廣泛應用于天然產物活性成分的分離和富集[4,6],但有關紫杉醇分子印跡聚合物的制備及其吸附特性的研究目前尚未見報道。本研究以紫杉醇為模板分子,在優(yōu)化了功能單體和溶劑的基礎上,制備了對紫杉醇具有高特異性吸附的印跡聚合物,為從植物中富集、分離微量紫杉醇提供了一種新材料。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

UV-2102 PC型紫外可見分光光度計,HY-4型調速多用振蕩器,UltiMate3000高效液相色譜儀。

紫杉醇,上海天偉生物制藥有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯,EGDMA,日本TCI公司；偶氮二異丁腈,AIBN,分析純,天津光復精細化工研究所,使用前用乙醇重結晶純化；丙烯酰胺,AM,Amresco公司；α-甲基丙烯酸,MAA,分析純,成都市科龍化工試劑廠,使用前用減壓蒸餾除去阻聚劑；2-乙烯基吡啶,2-VP,Sigma-Aldrich公司；4-乙烯基吡啶,4-VP,Sigma-Aldrich公司。所用其他試劑均為分析純,色譜分析所用試劑均為色譜純。

1.2 紫外光譜分析

選取MAA、AM、2-VP、4-VP 4種功能單體,固定紫杉醇的濃度為0.05 mmol/L,分別加入不同量的功能單體溶液,置于振蕩器振蕩30 min,冰箱中過夜,以相應濃度的功能單體溶液作參比,在200～300 nm掃描紫杉醇-功能單體溶液的紫外吸收光譜。

選取乙腈、氯仿、四氫呋喃3種溶劑,固定紫杉醇乙腈(或氯仿、四氫呋喃)的濃度為0.05 mmol/L,分別加入不同量的2-VP乙腈(或氯仿、四氫呋喃)溶液,置于振蕩器振蕩30 min,冰箱中過夜,以相應濃度的2-VP溶液作參比,在200～300 nm掃描紫杉醇-功能單體溶液的紫外吸收光譜。

1.3 紫杉醇分子印跡聚合物的制備

稱取0.1 mmol紫杉醇,溶于5 mL氯仿中,加入2-VP 0.6 mmol,在振蕩器中振蕩6 h,使紫杉醇與2-VP充分作用,而后加入3.0 mmol EGDMA,10 mg AIBN,充分混合后轉入50 mL磨口錐形瓶中,通氮氣10 min,密封,置60 ℃油浴中反應24 h,得到塊狀固體。將固體研磨過75 μm篩后,用甲醇/乙酸(體積比為9∶1)混合溶液索氏提取24 h,除去模板分子后,再用甲醇洗至中性。用丙酮反復沉降,除去過細粒子。晾干后60 ℃真空干燥至恒重,得到紫杉醇印跡聚合物(MIP)。

空白聚合物(non-imprinted polymer,N-MIP)的制備除不加模板分子外,其余與上述制備方法相同。

1.4 聚合物對模板分子紫杉醇的平衡結合實驗

準確稱取一組等量MIP和N-MIP 10 mg,分別置于1.5 mL的離心管中,加入0.10～0.40 mmol/L的紫杉醇-氯仿溶液1 mL,于室溫下振蕩18 h。用0.22 μm的濾膜過濾后,將濾液中的氯仿揮干,加入1 mL甲醇,用HPLC檢測,并計算出吸附平衡時溶液中紫杉醇的濃度,根據結合前后溶液中紫杉醇濃度變化計算出聚合物對紫杉醇的結合量Q(μmol/g)。

1.5 高效液相色譜分析

色譜柱Hypersil ODS2柱(4.6 mm ×250 mm,5 μm,大連依利特分析儀器有限公司)；流動相:體積比為50∶50的乙腈-0.1%甲酸水；體積流量1 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長229 nm。

2 結果與討論

2.1 功能單體的選擇

模板分子和功能單體在聚合前能否通過分子間相互作用形成穩(wěn)定的主客體復合物,是獲得高親和性和選擇性印跡聚合物的關鍵[7]。因此,選擇合適的功能單體對制備高識別性能的分子印跡聚合物是非常重要的。傳統選擇功能單體的方法是先合成印跡聚合物,然后評價功能單體對聚合物的影響,但這種方法耗時且耗費大量的材料。為快速、合理地評價在預聚合過程中模板分子和功能單體間的相互作用,本文采用紫外分光光度法對其進行了研究。

從紫杉醇與不同功能單體作用的一系列紫外吸收光譜圖(圖1)可以看出:隨著功能單體濃度的增大,紫杉醇的波峰強度逐漸降低,說明紫杉醇和4種功能單體均有作用力。加入功能單體后,模板分子的紫外吸收值越小,表明模板分子與功能單體的相互作用越強。比較圖1譜圖發(fā)現,4種功能單體中,2-VP與模板分子紫杉醇之間的作用力最強,是一種較理想的功能單體。從圖1(c)中可以看出,模板分子與功能單體的比例超過1∶6時,再增加功能單體的用量,吸收峰的強度變化明顯較弱。由此說明,適當增加功能單體的用量可使模板分子與功能單體的作用更充分,但并不是功能單體的用量越多越好,因為過量的功能單體可能導致非組裝的功能單體的殘基產生,從而非選擇性結合位點增加；也可能引起單體自身的締合,從而導致選擇性結合位點降低。綜合考慮各因素,本實驗選擇了模板分子紫杉醇與功能單體2-VP的摩爾比為1∶6來制備印跡聚合物。

Line (a) was obtained against pure solvent,and line (b)～(f) were obtained corresponding functional monomer solution as blanks. The concentration of taxol is 0.05 mmol/L,and the concentrations of functional monomer from lines (a) to (f) are 0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mmol/L,respectively.

圖1 不同功能單體存在下紫杉醇的紫外吸收光譜圖

Fig.1 UV absorption spectra of taxol in the presence of different functional monomers

2.2 紫杉醇與2-VP在不同溶劑中的相互作用

溶劑是合成聚合物的關鍵因素之一。在聚合過程中,一方面要求溶劑能夠溶解模板分子和功能單體等物質,另一方面要求溶劑與模板分子之間的相互作用力較小,不至于影響模板分子與功能單體之間形成主客體復合物的穩(wěn)定性[8]。本實驗研究了在乙腈、氯仿和四氫呋喃3種溶劑中紫杉醇和2-VP的相互作用。固定紫杉醇的濃度為0.05 mmol/L,加入不同量的2-VP后得到的紫外光譜均顯示:當逐漸增加體系中2-VP的濃度時,紫杉醇在乙腈、氯仿和四氫呋喃中吸收峰的吸光度呈下降趨勢,表明紫杉醇和2-VP在不同溶劑中均形成了配合物。紫杉醇(T)和2-VP(M)之間形成配合物可以表示為

(1)

由于反應中2-VP的濃度b0遠大于紫杉醇的濃度a0,參照文獻[9],紫杉醇與2-VP的結合反應公式可推導和整理如下表達式:

(2)

2.3 聚合物的吸附特性及Scatchard分析

在紫杉醇的濃度為0.10～0.40 mmol/L時,聚合物對紫杉醇的吸附等溫曲線如圖2所示。在所考察的濃度范圍內,MIP和N-MIP對紫杉醇均有吸附；開始時隨著紫杉醇濃度的增大,MIP和N-MIP結合量都快速增加,當濃度達到0.3 mmol/L時結合量均達到最大值,之后聚合物的吸附趨于飽和,且MIP對紫杉醇的結合量明顯高于N-MIP。表明兩種聚合物的空間結構存在差異,印跡過程中模板分子在MIP中留下的與之空間結構上匹配的具有多重作用點的三維空穴,這種空穴對模板分子具有高親和性和特異識別性,所以MIP對紫杉醇的結合量大；而在N-MIP中功能基團分布是任意的,沒有形成與模板分子在空間結構上互補的分子識別位點,對模板分子沒有特異選擇性,對紫杉醇的吸附主要是非特異性吸附,其吸附能力較弱,因而N-MIP對紫杉醇的結合量小。

表1 紫杉醇與2-VP在不同溶劑中的結合常數及摩爾比

圖2 紫杉醇在聚合物上的吸附等溫曲線

分子印跡研究中常用Scatchard模型來評價印跡聚合物的結合特性[4,9],Scatchard方程為

Q/c=(Qmax-Q)/KD

(3)

式中,KD為結合位點的平衡離解常數；Qmax為聚合物對紫杉醇的最大表觀結合量；c為平衡時溶液中紫杉醇的濃度；Q為平衡時聚合物對紫杉醇的結合量。以Q/c對Q作圖得到一條直線,如圖3所示。

圖3 MIP的Scatchard曲線

說明在所研究的濃度范圍內,MIP中存在一類等價的結合位點,它對紫杉醇呈現均勻的親和力。從圖3中直線的斜率和截距分別可以計算出KD=29.89 mg/L,Qmax=5.66 mg/g。

3 結 論

以紫杉醇為模板分子,采用本體聚合法首次合成了紫杉醇分子印跡聚合物。實驗結果表明,該印跡聚合物對模板分子具有高的結合量且結合特異性強?？蓪⑵溆糜诠滔噍腿〖吧V固定相,為紫杉醇的分離純化提供一種新的選擇性富集材料。

[1] 劉本葉,葉和春,李國鳳. 抗癌新藥紫杉醇的研究概況[J]. 植物學通報, 1995, 12(3):8-14.

[2] 王正平. 天然抗癌藥物——紫杉醇[J]. 應用科技, 2004, 31(1):56-68.

[3] 趙凱,周東坡. 抗癌藥物紫杉醇的提取與分離純化技術[J]. 生物技術通訊, 2004, 15(3):309-312.

[4] SONG Xing-liang, LI Jin-ha, WANG Jiang-tao, et al. Quercetin molecularly imprinted polymer: Preparation, recongnition, characteristics and properties as sorbent for solid-phase extraction[J]. Talanta, 2009, 80:694-702.

[5] 黃健祥,胡玉斐,潘加亮,等. 分子印跡樣品前處理技術的研究進展[J]. 中國科學B輯:化學, 2009, 39(8):733-746.

[6] ZHAI Chun-xiao, LU Qing, CHEN Xue-mei, et al. Molecularly imprinted layer-coated silica nanoparticles toward highly selective separation of diosgenin fromDioscoreanipponicaMakino[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216:2254-2262.

[7] HE Jian-feng, ZHU Quan-hong, DENG Qin-ying. Investigation of imprinting parameters and their recognition nature for qunine-molecularly imprinted polymers[J]. Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2007, 67:1297-1305.

[8] 盧陽春,何海成,馬向霞,等. 除草劑青莠定分子印跡聚合物的合成及結合性能研究[J]. 化學學報, 2004, 62(8):799-803.

[9] LI Ya-hui, YANG Tao, QI Xiao-ling, et al. Development of a group selective molecularly imprinted polymers based solid phase extraction of malachite green from fish water and fish feed samples[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 624:317-325.