山東地產(chǎn)藥材桔梗的HPLC指紋圖譜研究

宋健，王穎，石俊英*

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250 355）

山東地產(chǎn)藥材桔梗的HPLC指紋圖譜研究

宋健，王穎，石俊英*

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250 355）

目的：采用R P-HPL C對桔梗指紋圖譜進行方法學研究，建立桔梗藥材HPL C指紋圖譜。方法采用梯度洗脫方法進行色譜分離，測定10批藥材并記錄指紋圖譜，不同樣品的相似度采用國家藥典委員會制度的中藥色譜指紋圖譜相似度軟件計算。結果：在選定的色譜條件下標定出16個峰為桔梗指紋圖譜的共有峰。結論：該方法精密度高，重現(xiàn)性好，可為桔梗HPLC指紋圖譜提供依據(jù)。

桔梗；HPLC；指紋圖譜

桔梗來源于桔?？浦参锝酃laty codon grandiflo rum（Jacq.）A.DC.的干燥根，性味苦、辛、平，歸肺經(jīng)。具有宣肺，利咽，祛痰，排膿的功能。用于咳嗽痰多，胸悶不暢，咽痛音啞，肺癰吐膿［1］。桔梗藥材中含有皂苷類、多糖、脂肪酸、氨基酸等多種成分，其中皂苷類是主要的藥理活性成分。目前國內外對桔梗的研究主要集中在化學成分及藥理作用的研究［2-5］，缺乏綜合評價和分析藥材質量的方法。中藥指紋圖譜作為現(xiàn)代中藥質量控制和鑒別的新興技術，可全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例，在大多數(shù)中藥化學成分尚未闡明的現(xiàn)狀下，仍可有效表征中藥質量。本實驗采用R P-HPLC方法，首次對桔梗主要成分進行指紋圖譜研究，以期解決桔梗質量評價關鍵問題，為桔梗的綜合質量控制提供參考。

1 儀器與材料

AGILENT1100高效液相色譜儀；AGILENTCH EMSTATION工作站；AGIL ENT DAD檢測器。桔梗皂苷D（PlatycodinD）對照品（吉林農(nóng)業(yè)大學鄭毅男教授提供，純度＞98%。乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，水為超純水。

桔梗藥材來源見表1，樣品經(jīng)石俊英教授鑒定為桔?？浦参锝酃laty codongr and if lorum（Jacq.）A.DC.的干燥根。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈－水－2%磷酸梯度洗脫模式見表2；柱溫：30℃；流速：1.0m L·min－1；檢測波長：210nm；進樣量：10μL。

表110 批桔梗藥材來源及采收日期

表2 流動相線性梯度表

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的桔梗皂苷D對照品，加甲醇溶解，配成0.4m g·m L－1，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取桔梗粉末4g，加入甲醇30m L，浸泡過夜，超聲提取30min，過濾，濃縮，定容至5m L容量瓶中，0.45μm微孔濾膜過濾。

2.4 精密度試驗

取同一供試品溶液于高效液相色譜儀連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。對色譜圖中主要峰進行了保留時間和峰面積的精密度考察，經(jīng)分析 R S D分別在0.0 4%～0.79%，0.42%～3.0 8%，表明精密度良好。

2.5 重復性試驗

取同批次桔梗藥材5份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄色譜圖。對色譜圖中主要峰進行了保留時間和峰面積的重復性考察，經(jīng)分析R S D分別在0.0 6%～1.90%，1.96%～3.62%，表明此種提取方法和分析方法重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于0，2，4，8，24h進樣，記錄色譜圖。對色譜圖中主要峰進行了保留時間和峰面積的穩(wěn)定性考察，經(jīng)分析 R S D分別在0.0 8%～2.44%，1.0 3%～2.96%，表明桔梗主要成分在24h內穩(wěn)定。

3 結果

3.1 桔梗皂苷D的標定

分別進樣對照品與供試品溶液，記錄色譜圖，見圖1。由色譜峰保留時間確定S峰為桔梗皂苷D的色譜峰。

圖1 桔梗皂苷D對照品及桔梗樣品HPLC圖

3.2 圖譜測定時間的確定

取供試品溶液10μ L注入高效液相色譜議，記錄2h內色譜圖，結果表明樣品40m i n后無有意義峰出現(xiàn)，故選擇記錄時間為40m i n。

3.3 指紋圖譜的建立與分析

3.3.1 樣品指紋圖譜測定 取10批桔梗樣品按上述提取方法與色譜條件進行分析，記錄色譜圖，結果見圖2。

圖210 批桔梗藥材HPLC指紋圖譜

3.3.2 共有峰的標定 通過對上述10批桔梗樣品的測試分析和多次研究比較，利用國家藥典委員會制定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，歸納確定山東道地藥材桔梗的HPLC指紋圖譜具有16個共有的基本特征峰（由于3.5m i n之前的色譜峰分離不好，故將其作為一整體進行分析）。非共有峰面積均小于總峰面積的10%，符合中藥材指紋圖譜要求。以12號峰（桔梗皂苷D）為參照峰，各共有峰峰號、相對保留時間及相對峰面積見表3。

表3 特征峰峰號、相對保留時間及相對峰面積

3.3.3 相似度計算 利用國家藥典委員會制定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件，以沂源G A P基地產(chǎn)桔梗為參照，相似度（S）計算結果見表4。

表410 批桔梗樣品相似度

4 討論與小結

4.1 提取方法的選擇

實驗中以單因素方法篩選了提取溶劑（水、70%乙醇、乙醇、甲醇）、提取方式（直接超聲提取、浸泡過夜超聲提取、回流提取、索氏提?。?jīng)HPLC測試分析，結果表明甲醇浸泡過夜再超聲提取制備的供試品溶液最佳，可較多地提取桔梗中主要成分，提取方法簡捷、有效。

4.2 流動相的選擇

桔梗中所含成分復雜多樣，實驗中選用等度洗脫難以達到很好的分離，而采用梯度洗脫可以得到較好的分離效果。由于沒有文獻借鑒，我們考察了大量不同組合、不同比例的流動相，如甲醇－水－磷酸，乙腈－水－磷酸等。結果表明，乙腈－水－磷酸洗脫體系比甲醇－水－磷酸效果好，故選用乙腈－水－磷酸梯度洗脫。

4.3 檢測波長的選擇

通過從光譜圖數(shù)據(jù)中篩選信號，獲得分離色譜峰信息較多的檢測波長，再以此波長為指紋圖譜的檢測波長，進行研究。通過對210，225，245，268nm進行了優(yōu)選，結果表明在210nm處色譜圖所包含的峰數(shù)較多、信息量較大、各色譜峰分離較好，靈敏度較高。故選擇210nm作為檢測波長。

4.4 桔梗指紋圖譜研究方法的建立

本實驗以山東“道地”藥材桔梗為主，以河南、陜西、安徽等地的桔梗作對比，采用HPLC對桔梗主要化學成分指紋圖譜進行了研究，標定出16個峰為桔梗指紋圖譜的基本峰，確定12號峰為桔梗皂苷D，并將其選為參照峰（S），計算出了共有峰保留時間的比值（Rrt），共有峰峰面積的比值（Ra）和非共有峰峰面積比值等指紋圖譜評價標準。初步建立了桔梗指紋圖譜的研究方法，考察了10批桔梗的指紋圖譜，對其進行了相似度研究。桔梗為大宗常用藥材，由于其成分復雜以及化學對照品較少，對桔梗的研究一直處于較低水平，本實驗首次采用HPLC完成了對山東地產(chǎn)藥材桔梗指紋圖譜的研究，為桔梗指紋圖譜的建立提供了科學依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：259-260.

［2］何美蓮，程小衛(wèi)，陳家寬，等.桔梗皂苷類成分及其質量分析［J］.中藥新藥與臨床藥理，2005，16（6）：457-460.

［3］徐寶軍，鄭毅男，崔勐，等.電噴霧串聯(lián)質譜法鑒定桔梗皂苷D［J］.中國藥物化學雜志，2000，10（3）：193.

［4］Lee JY，Yoon JW，Kim CT，et al.Antioxidant activity of phenylpropanoid esters is olated and identified from Platyc-odon grandiflorum A.DC［J］.Phytochemistry，2004，65（22）：30 33-30 39.

［5］Reininger EA，Bauer R.Prostaglandin-H-synthase（PGHS）-1and-2 microtiter assays for the testing of herbal drug sand in vitro inhibiti on of PGHS-isoenzyms by polyunsaturated fatty acids from Platycodi radix［J］.Phytomedicine，2006，13（3）：164-169.

Stud yon Fingerprint of Platycodonis Radix by HPLC

SONGJian，WANGYing，SHIJun-ying
（Shandong University of Tcm，Jinan 250355，China）

Objective：To study the methodology of fingerprint by RP-HPLC in order to establish the fringerprint of Platycodonis Radix.Methods：A gradient mobile system was applied in the experiment.The fingerprints of ten habi-tats were recorded and compared with similarity evaluation software published by committee of codex.Results：Sixteen peaks were identified as the characteristic finger prints of Platycodonis Radix.Conclusion：This method shows high pre-cision and good repeatability，and it can provide the basis for studing the HPLC fingerprint of Platycodonis Radix.

Platy codon is Radix；HPLC；Finger print

山東省重大科技攻關專項（S D S P 2005-0 720-0 6）

*石俊英，E-m a i l：s j y 50 12＠126.c om

2011-0 3-22）