短小芽孢桿菌木聚糖酶的同源建模及分子動力學模擬

葛慧華,李紅春,張光亞

(華僑大學化工學院,福建泉州 362021)

短小芽孢桿菌木聚糖酶的同源建模及分子動力學模擬

葛慧華,李紅春,張光亞

(華僑大學化工學院,福建泉州 362021)

克隆并測序來源于短小芽孢桿菌的木聚糖酶基因,測定其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)并鑒定其表達產(chǎn)物為常溫酶蛋白.利用同源建模構(gòu)建出具有較高精度的三級結(jié)構(gòu)模型,并進行優(yōu)化和評估.利用分子動力學模擬木聚糖酶基因?qū)岵环€(wěn)定的分子機制,了解影響該酶熱穩(wěn)定性的因素,尋找對熱不穩(wěn)定性的區(qū)域.通過與嗜熱木聚糖酶比較發(fā)現(xiàn),兩者在3個區(qū)域的分子動力學行為存在較明顯的差異.

木聚糖酶;短小芽孢桿菌;同源建模;熱穩(wěn)定性;分子動力學模擬

木聚糖酶(EC3.2.1.8)是一種重要工業(yè)用酶,屬于F/10和 G/11家族.由于 G/11家族的木聚糖酶分子更小,且其結(jié)構(gòu)較為簡單,更適合作為理論研究分子的模型[1],用于極端條件下木聚糖酶催化模式系統(tǒng)及蛋白質(zhì)分子折疊機理等的研究.分子動力學模擬能提供在不同溫度下,極短時間內(nèi)蛋白分子構(gòu)象的變化,是研究蛋白質(zhì)去折疊或者變性機理的重要手段,它有著實驗無法比擬的優(yōu)勢[2-3].然而,國內(nèi)大多數(shù)分子動力學研究主要集中于小分子物質(zhì),而對生物大分子的研究相對較少[2,4-5].本文獲取了來源于短小芽孢桿菌木聚糖酶基因,測定其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì),構(gòu)建出具有較高精度的三級結(jié)構(gòu)模型,并進行了分子動力學模擬.

1 材料與方法

1.1 材料

短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus,中國普通微生物菌種保藏管理中心);E.coliDH5α(中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所吳乃虎教授惠贈);質(zhì)粒pMD18-T,DNA回收試劑盒Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0,限制性內(nèi)切酶及其緩沖液(大連TaKaRa公司).

1.2 方法

1.2.1 引物 參考其他來源于芽孢桿菌屬的木聚糖酶序列,使用DNA club輔助設(shè)計引物,并在5’端分別加上Bam HⅠ和XhoⅠ的限制性內(nèi)切酶位點.設(shè)計的上游引物L1:5/GCGCGGA TCC A TGAA TTTGA GAAAA TTAAG3/;下游引物L 2:5/GA TGCTCGA T GTTGCCAA TAAACA GCTGA TTG3/.L 1和L 2中的劃線部分分別是Bam HⅠ和XhoⅠ的酶切位點.引物委托北京奧科公司合成,基因測序由北京華諾公司完成.

1.2.2 同源建模及模型評估 將返回的測序結(jié)果翻譯成蛋白質(zhì),并在SW ISS-MODEL上完成同源建模[6];利用M etaMQA P[7]對模型進行評估及優(yōu)化.

1.2.3 分子動力學模擬 分子動力學模擬軟件為NAMD,視圖、建模和數(shù)據(jù)處理軟件為其輔助軟件VMD[8].使用的力場為經(jīng)驗力場CHARMM力場.其基本過程分為如下幾步:(1)能量最小化;(2)溶解蛋白;(3)加入離子;(4)體系升溫(此處溫度為400 K);(5)最終的分子動力學模擬.

2 木聚糖酶的基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)

以短小芽孢桿菌Bacillus pum illus基因組DNA為模板,利用 P1和 P2為引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),擴增得到編碼木聚糖酶的xynA基因.PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖1所示.由圖1可見,擴增片段大小約為700 bp,與實際大小的680 bp吻合.

根據(jù)Taq DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3’末端加1個“A”堿基的特性,將PCR產(chǎn)物切膠回收后,與 T載體pMD18-T連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH 5α.利用氨芐青霉素進行初步篩選,挑取5～6個轉(zhuǎn)化子擴培,抽提質(zhì)粒,進行單、雙酶切鑒定.

重組質(zhì)粒pMD-xynA用BamHⅠ單酶切,得到一條大小約3.4 kp的片段,如圖2(a)所示.這是空載體與目的基因大小之和.用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切,得到兩條大小分別為2.7 kp和700 bp的片段,如圖2(b)所示.它們分別是空載體和目的基因的大小.這表明目的基因已成功插入表達載體pMD 18-T中.測序結(jié)果表明,其開放閱讀框(ORF)的長度為687 bp.經(jīng)BLAST比對證實,該基因為編碼木聚糖酶基因,在NCB I的登錄號為EF090270.

該酶經(jīng)表達并測定,其最適溫度為50℃[9].進一步測定酶在不同溫度下保溫30 min后殘留的酶活力,結(jié)果如圖3所示.由圖3可知,在70℃時保溫30 min殘留的酶活力僅有25%左右,而在80℃以上則幾乎完全失活,這說明其高溫耐受性較差.與大多數(shù)來源于芽孢桿菌的木聚糖酶相比[10],其理化性質(zhì)較為接近.從其最適溫度及熱穩(wěn)定性可以判斷,該木聚糖酶屬于常溫酶蛋白.

圖1 xynA基因的PCR擴增Fig.1 Electropho resis of PCR products of xynA

圖2 重組克隆載體pMD-xynA 的限制酶酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant cloning vector pMD-xynA digested by restriction enzyme

圖3 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermostability of xylanase

3 木聚糖酶的同源建模

木聚糖酶基因(編號:EF090270)編碼的木聚糖酶蛋白序列總長度為228個氨基酸.通過在PDB數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)它與編號為1IGO的(來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis)木聚糖酶同一性最高,可達84.58%,以其為模板進行三級機構(gòu)的同源建模.

由于所獲得的木聚糖酶存在一個長度為27個氨基酸的信號肽,因此在同源建模過程中去掉了這一段序列.為了保證后續(xù)分子動力學研究的準確性,需要充分評估建模獲得的三級結(jié)構(gòu)的可靠性.

4 木聚糖酶的結(jié)構(gòu)評估及優(yōu)化

利用Sw iss-model進行同源建模后,使用了目前較好的評估方法M etaMQAP對其進行評估和結(jié)構(gòu)優(yōu)化.評估結(jié)果表明,該模型準確率得分值為84.701,均方根誤差為1.299,說明模型可靠性很高.

針對每個氨基酸殘基中原子-原子相互作用,二級結(jié)構(gòu)類型、水分子可及性,以及與其他氨基酸殘基的相互作用等因素得到的分值(P)和MetaMQAP的全局得分值(M),如圖4所示.由圖4可見,大多數(shù)氨基酸殘基都位于得分較高的區(qū)域.

經(jīng)優(yōu)化后的木聚糖酶三級結(jié)構(gòu),如圖5(a)所示;然后,在VADAR上構(gòu)建其結(jié)構(gòu)的拉氏圖,如圖5 (b)所示.由圖5(b)可見,絕大多數(shù)氨基酸殘基都落在允許的區(qū)域,它對應(yīng)于可接受的側(cè)鏈環(huán)境.綜上可知,優(yōu)化后的三級結(jié)構(gòu)是可靠的.

圖4 木聚糖酶三級結(jié)構(gòu)模型的評估Fig.4 Evaluation of the 3D structure of xylanase

圖5 木聚糖酶三級結(jié)構(gòu)及其拉氏圖Fig.5 3D structure of xylanase and its Ramachandran plot

5 木聚糖酶分子動力學模擬

為了對比并了解該常溫木聚糖酶的分子動力學行為,選取了編號為1F5J(來源于嗜熱菌D ictyog lom us thermophilum)的木聚糖酶.該酶長度為199個氨基酸,和獲取木聚糖酶模型(201個氨基酸)長度相近,其最適溫度為75℃,具有較好的熱穩(wěn)定性,為嗜熱酶蛋白[11].在400 K溫度下,兩種木聚糖酶各殘基RM SD(差異均方根)值[2]的分布,如圖6所示.由圖6可知,在整個模擬的過程中,各位點RM SD的變化趨勢類似,這可能和它們相似的結(jié)構(gòu)有關(guān).

圖6 木聚糖酶各殘基的RMSD值Fig.6 RMSD values of the xylanase residues

然而,嗜熱木聚糖酶1F5J在整個模擬過程中RM SD普遍高于常溫木聚糖酶,說明其嗜熱木聚糖酶分子的柔性更強,尤其在其N端,第30位至42位、第122位到134位之間.研究表明,N端對于木聚糖酶的熱穩(wěn)定性非常重要.一般情況下,常溫木聚糖酶N端較短,且在其N端有一段不規(guī)則loop結(jié)構(gòu);而嗜熱蛋白則往往是一段β-折疊.已有實驗證實,將黑曲霉中木聚糖酶A的N端用嗜熱菌Thermom onospora fusca中木聚糖酶的N端替換后,其熱穩(wěn)定性和催化活性均有提高[12].

從所獲得木聚糖酶xynA的三級結(jié)構(gòu)可以看出,在其N端也有一段長約10個左右的氨基酸形成了一段loop結(jié)構(gòu),連接著兩段很短的β-折疊,這印證該酶為常溫酶蛋白.中間的30～42位區(qū)間主要是β-折疊和loop連接的區(qū)域,它們是形成木聚糖酶疏水核(hydrophobic core)的部分;而第122位到134位間則主要是兩段短的β-折疊通過loop連接而成,也是一段柔性較強的區(qū)域.在159位到168位是該分子中所具有最長的一段(也是唯一一段)α-螺旋區(qū)域,這是一段相對剛性的區(qū)域.因此,在整個模擬過程中變化不大,與之前報道吻合[13].在第100位和第180位附近的區(qū)域,兩種酶的差異較小.經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),這兩個區(qū)域是木聚糖酶活性位點所在的區(qū)域.有趣的是,該酶活性位點都分布在這些區(qū)域.

6 結(jié)束語

研究木聚糖酶的分子動力學特性,能提供另一種研究該酶熱穩(wěn)定性的機制,同時也能尋找出較早發(fā)生熱變性的區(qū)域(或者是對熱不穩(wěn)定性的區(qū)域).這就是后續(xù)突變需要改造的區(qū)域.可見,分子動力學模擬可為酶的定向改造提供有價值信息.

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(責任編輯:黃曉楠英文審校:劉源崗)

Homology Modeling and Molecular Dynam ic Simulation of Xylanase from Bacillus pum ilus

GE Hui-hua,L IHong-chun,ZHANG Guang-ya
(College of Chemical Engineering,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

The gene of xylanase fromBacillus pumiluswas cloned and sequenced.This xylanase was identified as a me-sophilic enzyme.The tertiary structure of the xylanase originated from homology modeling was evaluated and op timized. Based on the optimal structure,molecular dynamic simulation of the mesophilic xylanase and a thermphilic one was performed using NAMD.The results showed that there were three regions which showed differences between the mesophilic and thermophilic xylanase.The molecular dynamic analysis suggested regions in the protein structure which were mo re unstable and thus potential targets for mutation to imp rove its thermostability.

xylanase;Bacillus pum ilus;homology modeling;thermostability;molecular dynamic simulation

Q 71;Q 55

A

1000-5013(2011)03-0296-04

2010-01-19

張光亞(1975-),男,副教授,主要從事生物信息與生物化工的研究.E-mail:zhgyghh@hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目(2009J01030);華僑大學科研基金資助項目(07HZR20)