不同毒力瘧原蟲感染早期根治性治療對再感染體液免疫應答的影響

劉英杰，李瑩，潘艷艷，鄭麗，劉軍，單風平，曹雅明*

( 1.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧沈陽110001 ; 2.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001 )

不同毒力瘧原蟲感染早期根治性治療對再感染體液免疫應答的影響

劉英杰1，李瑩2，潘艷艷2，鄭麗2，劉軍2，單風平2，曹雅明2*

( 1.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學教研室，遼寧沈陽110001 ; 2.中國醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001 )

為探討不同毒力瘧原蟲感染早期根治性治療對再感染體液免疫應答的影響，用致死型和非致死型約氏瘧原蟲感染DBA/2小鼠，感染后3 d進行根治性治療，并于初次感染后90 d進行再感染。計數(shù)紅細胞感染率和檢測再感染前(0 d)和再感染后(1、3、5 d)不同時間點脾細胞中活化性B細胞百分率以及血清中IgG、IgG1和IgG2a水平，結(jié)果顯示，再感染后2組小鼠均出現(xiàn)短暫的低水平蟲體血癥，再感染后第3天活化性B細胞、IgG、IgG1和IgG2a均出現(xiàn)有意義的升高，但在每一相同檢測時間點，2組小鼠的蟲體血癥、活化性B細胞百分率、IgG、IgG1和IgG2a水平均沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，不同毒力瘧原蟲感染早期的根治性治療并不影響宿主在再感染時產(chǎn)生有效的體液免疫應答，強毒株原蟲感染也能獲得與弱毒株相同的可抵御再感染的能力。

不同毒力瘧原蟲;根治性治療;再感染;體液免疫應答

我國流行的瘧疾主要由惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲感染所致，但2個蟲種的毒力存在明顯差異，其中前者毒力較強，是導致腦瘧等嚴重并發(fā)癥發(fā)生的主要蟲種。瘧疾流行的顯著特征是反復感染普遍存在。與惡性瘧感染相比，機體針對間日瘧感染產(chǎn)生保護性免疫應答更為迅速，其抵御再感染的能力也明顯優(yōu)于惡性瘧感染者［1］。這表明原蟲毒力差異與抵御再感染的保護性免疫建立存在密切相關(guān)性。特異性抗體是抵御再感染的主要效應分子［2］，但毒力不同蟲株感染早期根治性治療后，其在再感染過程中體液免疫應答是否存在差異，目前尚未見明確報道。致死型約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii 17XL，P.y17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii 17XNL，P.y17XNL)分別與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲具有相似的生物學特性［3］。為此，對P.y17XL和P.y17XNL感染早期DBA/2小鼠進行根治性治療，然后用同種瘧原蟲進行再感染，通過對再感染前后體液免疫應答相關(guān)分子水平進行檢測，探討了毒力不同瘧原蟲感染早期的根治性治療對再感染體液免疫應答的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材雌性，6～8周齡DBA/2小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所;P.y17XL和P.y17XNL由日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈。

1.1.2 藥品與試劑氯喹和青蒿琥脂片分別購自上海中西藥業(yè)有限公司和廣西桂林藥業(yè)有限公司;細胞熒光標記抗體、HRP-羊抗鼠IgG(IgG1或IgG2a)及底物均購于BD Pharmigen。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染和治療及再感染小鼠經(jīng)腹腔分別接種P.y17XL和P.y17XNL(1×106)寄生的紅細胞，尾靜脈采血，觀察紅細胞感染率。初次感染后3 d，經(jīng)口給藥(青蒿琥脂片60 mg/kg，氯喹90 mg/kg)治療，每天1次，連續(xù)3 d，待初次感染后90 d，小鼠用同種瘧原蟲再次感染。

1.2.2 血清收集心臟采集再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5天小鼠血液。收集血清，待抗體檢測。

1.2.3 脾細胞中活化性B細胞百分率的檢測無菌取出上述時間點小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，調(diào)脾細胞終濃度為1×107/mL。每份樣品用Per-CP-conjugated anti-mouse B220和PE-conjugated anti-mouse CD69進行雙色分析。在預先加入封閉抗體的染色管中加入脾細胞懸液0.1 mL，再加入抗B220-PerCP和抗CD69-PE mAb進行表面染色，流式細胞儀檢測。

1.2.4 血清抗體檢測以P.y17XL和P.y17XNL抗原(10 μg/mL)包被酶標板，常規(guī)加入抗血清(1∶100稀釋)、HRP-羊抗鼠IgG(IgG1或IgG2a)、底物、終止液，酶標儀檢測492 nm處OD值。

1.2.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS11.5統(tǒng)計學分析軟件，Student’s-t檢驗比較各組均值的顯著性差異，P＜0.05為差異顯著(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠再感染后不同時間的原蟲血癥水平

如圖1所示，感染早期根治性治療小鼠在再感染過程中均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲體血癥。在再感染后每一檢測時間點，不同毒力蟲株的蟲體血癥水平基本相似，并均于攻擊后第6天左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲體血癥水平持續(xù)升高。這表明，毒力不同瘧原蟲初次感染早期根治性治療的小鼠對同種瘧原蟲的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 P.y17XL和P.y17XNL初次感染和再感染后的蟲體血癥水平Fig.1The levels of parasitemia after primary infection and reinfection with P.y17XL and P.y17XNL

2.2再感染前后不同時間點脾細胞中活化性B細胞的百分率

如圖2所示，與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比，再感染后第3天小鼠脾細胞中活化性B細胞百分率即出現(xiàn)了有意義的升高(P＜0.01)，表明再感染前小鼠體內(nèi)存在一定數(shù)量的記憶性B細胞;但其此后進一步升高，則提示除記憶性B細胞活化外，可能又有一些初始B細胞開始活化。盡管P.y17XL再感染鼠的活化性B細胞百分率略高于P.y17XNL再感染鼠，但沒有顯著性差異。這表明毒力不同蟲株感染早期根治性治療后，其毒力強弱未使宿主在再感染時B細胞的活化水平產(chǎn)生明顯變化。

2.3 小鼠再感染前后不同時間點特異性IgG和IgG1以及IgG2a水平

如圖3(ABC)所示，與未感染的正常小鼠相比，2種小鼠再感染前血清中即存在高水平IgG、IgG1和IgG2a(*P＜0.05或＊＊P＜0.01);與再感染前相比，感染后第3天這些抗體明顯增加(☆P＜0.05或☆☆P＜0.01)，此后繼續(xù)升高，這與活化性B細胞百分率的升高完全同步。在每一檢測時間點，不同毒力蟲株感染鼠的這些抗體水平基本相似。

圖2 再感染前后不同時間點脾細胞中活化性B細胞的百分率Fig.2The percentage of actived B cells in spleen cells from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

圖3 小鼠再感染前后不同時間點特異性IgG和IgG1以及IgG2a水平Fig.3The levels of specific IgG and IgG1 as well as IgG2a in sera from mice pre-and post-reinfection with P.y17XL and P.y17XNL at different time points

3 討論

有資料顯示，間日瘧再感染后的蟲荷水平僅為初次感染后的1/10左右，并且患者沒有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)［4］;與初次感染相比，惡性瘧再感染后的蟲荷水平雖有所下降，但多數(shù)感染者仍具有較高的蟲荷水平，同時有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)［5］。這表明，原蟲毒力差異與再感染的保護性免疫效應存在密切相關(guān)性。本研究顯示，P.y17XL和P.y17XNL感染早期根治性治療后，其在同種瘧原蟲再感染過程中均出現(xiàn)短暫的低水平蟲體血癥，并且2種原蟲的蟲荷水平基本相同，表明初次感染早期根治性治療后，小鼠獲得了相似的抵御再感染的免疫保護。特異性IgG是抵御再感染的主要效應分子，尤其是IgG2a的免疫保護效應更強［6］。實驗證實，在再感染后每一相同檢測時間點，2組小鼠活化性B細胞百分率的升高幅度是相似的;IgG、IgG1和IgG2a水平在再感染前均明顯高于正常對照鼠，并且在再感染后逐漸升高，但無論是再感染前或再感染后，2組小鼠的IgG、IgG1和IgG2a水平在相同檢測時間點均無顯著差異。有研究證明，強毒株瘧原蟲對宿主的免疫器官具有明顯的損傷和破壞作用［3］;抗原劑量可改變宿主的免疫應答類型和強度［7-8］。據(jù)此認為，當P.y17XL和P.y17XNL感染的紅細胞在外周血出現(xiàn)時即進行根治性治療可使小鼠受到相同蟲荷的抗原刺激，同時也抑制了P.y17XL對小鼠免疫系統(tǒng)的破壞作用，因此2組小鼠在再感染時產(chǎn)生相似的免疫保護。

綜上所述，瘧疾感染早期根治性治療并不影響宿主在再感染時產(chǎn)生有效的體液免疫應答，強毒株原蟲感染也能獲得與弱毒株相同的抵御再感染能力。

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［2］Reiling L，Richards JS，F(xiàn)owkes FJ，et al.Evidence that the erythrocyte invasion ligand PfRh2 is a target of protective immunity against Plasmodium falciparum malaria［J］.J Immunol， 2010，185(10):6157-6167.

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［4］Collins WE，Jeffery GM，Roberts JM.A retrospective examination of reinfection of humans with Plasmodium vivax［J］.Am J Trop Med Hyg，2004，70(6):642-644.

［5］Collins WE，Jeffery GM.A retrospective examination of secondary sporozoite-and trophozoite-induced infections with Plasmodium falciparum:development of parasitologic and clinical immunity following secondary infection［J］.Am J Trop Med Hyg，1999，61(1 Suppl):20-35.

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［8］Freitas do Rosário AP，Muxel SM.Gradual decline in malariaspecific memory T cell responses leads to failure to maintain long-term protective immunity to Plasmodium chabaudi AS despite persistence of B cell memory and circulating antibody［J］.J Immunol，2008，181(12):8344-8355.

Effect of Radical Cure in Early Phase of Primary Infection with Different Virulent Plasmodia on Humoral Immune Response to Homologous Reinfection

LIU Ying-jie1，LI Ying2，PAN Yan-yan2，ZHENG Li2，LIU Jun2，SHAN Feng-ping2，CAO Ya-ming2
(1.Teach.＆Res.Div.of Pathogen Biol.; 2.Teach.＆Res.Div.of Immun.，Coll.of Basic Med.Sci.，China Med.Uni.，Shenyang 110001)

In order to investigate the effect of radical cure in early phase of primary infection with different virulent plasmodia(Vp)on humoral immune response to homologous reinfection，DBA/2 mice were infected respectively with P.y17XL and P.y17XNL parasited erythrocytes，and radically cured on 3 d after infection.The mice were reinfected respectively with P.y17XL and P.y17XNL on 90 d after primary infection，then the level of parasitemia and specific IgG，IgG1 and IgG2a in sera as well as percentage of activated B cells in spleen cells were observed.The results showed that parasitemia in post-reinfection mice was transient and extremely low，and the percentage of activated B cells，specific IgG，IgG1 and IgG2a in these mice began to increase on 3 d of post-reinfection，however，in each testing time point the levels of parasitemia，IgG，IgG1 and IgG2a as well as the percentage of activated B cells from two groups of mice were not significantly different.These results suggested that radical cure in early phase of primary infection with different Vp had less effect on humoral immune response to homologous reinfection，Vp infection，being similar to low Vp infection，could also get the ability to resist reinfection.

different virulent plasmodia;radical cure;reinfection;humoral immune response

R382.3

B

1005－7021(2011)01－0102－04

劉英杰男，醫(yī)學碩士，副教授。主要從事瘧疾感染與免疫研究。E-mail:lyjcmu@yahoo.com.cn

*通訊作者。E-mail:yamingcao@yahoo.com.cn

2011-01-02;

2011-01-21