甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

賀軍軍，羅萍，陳永輝，易潤(rùn)華，李勤奮，戴小紅

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東湛江524013;2.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江524088; 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南儋州571737)

甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

賀軍軍1，羅萍1，陳永輝1，易潤(rùn)華2，李勤奮3*，戴小紅1

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站，廣東湛江524013;2.廣東海洋大學(xué)，廣東湛江524088; 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南儋州571737)

通過利用多種選擇性培養(yǎng)基，從自然發(fā)酵不同階段的甘蔗渣中分離到多種纖維素分解菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，獲得了降解纖維素的功能菌株c1g3-3及其最適功能培養(yǎng)基蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS)，并通過形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

甘蔗渣;纖維素;功能降解菌

甘蔗是我國大宗的糖料經(jīng)濟(jì)作物，在我國熱區(qū)的經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，是廣西和云南的主要產(chǎn)業(yè)。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的主要副產(chǎn)品，屬于農(nóng)業(yè)固體廢棄物，主要組分:干物質(zhì)90%～92%，粗蛋白質(zhì)2.0%，粗纖維44%～46%，粗脂肪0.7%，無氮浸出物42%，粗灰分2%～3%［1］，如果不加以處理或利用會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，甘蔗渣的利用一直受到重視［2-8］。近幾年，隨著生物有機(jī)肥的快速發(fā)展，甘蔗渣成為生物有機(jī)肥堆制原料而受到重視，并配置成有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)上得到應(yīng)用［9］。然而，由于甘蔗渣中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量高(占90%以上)，降解速度慢、堆肥時(shí)間長(zhǎng)，造成嚴(yán)重環(huán)境污染，成為肥料化利用的制約因素和研究重點(diǎn)。本文從甘蔗渣資源化利用的角度出發(fā)，通過對(duì)多種分離源的微生物進(jìn)行分離、純化和篩選，得到了快速降解甘蔗渣纖維素功能降解菌株，并對(duì)其生理特性及其培養(yǎng)條件進(jìn)行探討，以期為工廠化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料采集用于分離的甘蔗渣采自廣東省豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司堆積場(chǎng)中。

1.1.2 供試分離和篩選培養(yǎng)基①樣品分離采用4種培養(yǎng)基，具體如下:赫奇遜CMC培養(yǎng)基(C1):NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，NaNO32.5 g，CMC 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;赫奇遜CMC-Na培養(yǎng)基(C2):NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，NaNO32.5 g，CMC-Na 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基(C3): (NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 10 g，瓊脂20 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 L，pH值自然;纖維素剛果紅平板培養(yǎng)基(C4):(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，CMC 10 g，瓊脂20 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 L，pH值自然;②功能菌株篩選培養(yǎng)基，具體如下:Dubos纖維素培養(yǎng)基: NaNO30.5 g，K2HPO41 g，F(xiàn)e2(SO4)3·7H2O 0.001 g，CMC 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.5;Hutchison培養(yǎng)基:NaNO32.5 g，NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，CMC 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;磷酸銨鈉培養(yǎng)基:Na(NH4)HPO42 g，CaCO35 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，蒸餾水1 L，纖維素5 g;蛋白胨纖維素培養(yǎng)基:NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，剛果紅0.1 g，蛋白胨5 g、酵母膏5 g，纖維素5 g，微量元素溶液0.5 mL(微量元素液成分(g/L):ZnSO40.30，CaCl20.25，CuSO40.25，F(xiàn)eSO40.20)，蒸餾水1 L，50℃靜置培養(yǎng);改良纖維素剛果紅培養(yǎng)基(g/L):NaCl 0.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，纖維素粉5，蛋白胨1，蒸餾水1 L，pH值自然; CMC培養(yǎng)基:(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，CMCNa 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離采用平板稀釋法進(jìn)行分離。稱取甘蔗渣樣品1.00 g，加入無菌水10 mL，在振蕩機(jī)上振蕩10 min，形成懸液，吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10－6，取10－6稀釋液0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基中，每處理重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)72～96 h，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存。

1.2.2 纖維素功能降解菌的篩選菌株初篩采用濾紙分解法，將濾紙剪成小條，放入試管中，使其略露出液面。將各菌株接種到以濾紙為唯一碳源的Dubos液體培養(yǎng)基中，然后于30℃、110 r/ min振蕩培養(yǎng)5 d，觀察濾紙的崩解效果;在初篩的基礎(chǔ)上，以FPA酶(3.5-乙硝基水楊酸比色法測(cè)定)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)一步篩選得出纖維素功能降解菌株。

1.2.3 培養(yǎng)基篩選將篩選得到的功能菌株分別接種到菌株篩選培養(yǎng)基中，進(jìn)行功能培養(yǎng)基的篩選，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 菌株鑒定對(duì)篩選出的纖維素降解菌進(jìn)行種的鑒定:①形態(tài)學(xué)特征鑒定:將篩選出的纖維素降解菌接種于PDA平板中，28℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察其菌落的生長(zhǎng)情況、外觀形態(tài);②生理生化特征:主要包括過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶試驗(yàn)，糖、醇類分解試驗(yàn)，V-P測(cè)定，明膠液化，淀粉水解，丙二酸利用，吲哚產(chǎn)生及生長(zhǎng)pH值和溫度的測(cè)定等，方法參考東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［10］;③分子鑒定:細(xì)菌的16S rRNA分析:經(jīng)改良的SDS法提取菌株降解微生物的基因組DNA。PCR引物為細(xì)菌鑒定通用引物:16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，16(－)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3。25 μL擴(kuò)增體系:模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.5 μL，DNTP(2 mmol/L)2.5 μL，Taq(3 U/μL) 0.35 μL，ddH2O 13.15 μL。

將提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，50℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)條件下檢測(cè)，回收目標(biāo)DNA片段，由生工生物工程(上海)有限公司完成測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，以Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)后，用MEGA4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株分離

由表1可見，培養(yǎng)基C1最適合分離纖維素降解菌，在樣品稀釋到10－6時(shí)，每個(gè)平板可以得到菌落數(shù)5.20 cfu/g;其次是C3和C2分離效果較好，分離菌落數(shù)分別為3.20和2.80 cfu/g;而C4的分離效果較差。

表1 不同培養(yǎng)基纖維素降解菌株分離效果(單位:cfu/g)Table 1Effect of cellulose degradation strains in different mediums(Unit:cfu/g)

2.2 功能菌株初篩

采用濾紙分解法對(duì)纖維素降解菌進(jìn)行初篩，由表2可見，從甘蔗渣中共分離出27個(gè)菌株，其中降解能力強(qiáng)的有5個(gè)菌株，中度降解能力的有5個(gè)菌株，輕微降解能力的有13個(gè)菌株及沒有任何降解能力的4個(gè)菌株。

表2 纖維素降解功能菌株初篩Table 2First screening of cellulose degrading-bacteria

2.3 功能菌株復(fù)篩

濾紙中的纖維素含量較高，F(xiàn)PA酶水解濾紙中的纖維素，釋放出的還原糖與3，5-乙硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化，這種顏色變化與釋放的還原糖量成正比關(guān)系，即與酶樣品的酶活性成正比關(guān)系。通過對(duì)FPA酶活性來評(píng)價(jià)初篩菌株對(duì)纖維素降解能力的大小，從而確定纖維素降解高效菌株。通過實(shí)驗(yàn)表明:c1g3-3菌株的FPA酶活性最好，為4.83 μg/(mL·h)，被確定為纖維素功能降解菌株(表3)。

表3 纖維素降解功能菌株復(fù)篩(單位:μg/(mL·h))Table 3Second screening of cellulose degrading-bacteria (Unit:μg/(mL·h))

2.4 功能培養(yǎng)基篩選

利用功能菌株在不同培養(yǎng)基上的FPA酶活性來評(píng)價(jià)菌株功能發(fā)揮的最適培養(yǎng)基。由表4可知:c1g3-3 FPA酶活性在6種不同培養(yǎng)基表現(xiàn)不一，在蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS)上活性最高為54.85 μg/(mL·h)。因此，c1g3-3菌株最適功能培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS)。

表4 功能菌株在不同培養(yǎng)基上FPA酶活(單位:μg/(mL·h))Table 4FPA enzyme activity of degrading-bacteria in different mediums(Unit:μg/(mLl·h))

2.5 高效菌株鑒定

2.5.1 表面形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)c1g3-3菌株菌落顏色黃白色，表面濕潤(rùn)、光滑，邊緣不整齊;桿菌，革蘭染色顯陰性，周生鞭毛，輕微彎曲的桿狀，大小為0.55 μm×1.58 μm，菌株生理生化測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 c1g3-3菌株的生理生化特征Table 5Physiological and biochemical characteristics of c1g3-3 strain

續(xù)表

2.5.2 分子鑒定c1g3-316S rDNA堿基長(zhǎng)度為1.5 bp左右，將菌株的16S rDNA全序列輸入GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與無色桿菌屬(Achromobacter xylosoxidans)之間的同源性達(dá)到99%。選取近緣的菌株序列通過N-J算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)，將其初步定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

圖1 c1g3-3菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of c1g3-3 strain

3 小結(jié)與討論

本文以甘蔗渣堆肥所需菌劑的開發(fā)為主，通過對(duì)多種分離源的纖維素降解菌進(jìn)行分離、純化和篩選，從甘蔗渣中獲得了2株纖維素降解功能菌，并對(duì)其進(jìn)行了最佳培養(yǎng)基的篩選與鑒定。通過試驗(yàn)得出以下結(jié)論:①利用多種選擇培養(yǎng)基，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，從自然發(fā)酵不同階段的甘蔗渣中獲得了纖維素功能降解菌株c1g3-3;②c1g3-3菌株最適功能培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)基(PCS);③通過形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

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Screening and Identification of Cellulose Degrading-Bacteria from Fermented Bagasse

HE Jun-jun1，LUO Ping1，CHEN Yong-hui1，YI Run-hua2，LI Qin-fen3，DAI Xiao-hong1
(1.Zhanjiang Res.Sta.，CATAS，Zhanjiang 524013;2.Guangdong Ocean Uni.，Zhanjiang 524088; 3.Inst.of Envir.＆Plant Prot.，CATAS，Danzhou Hainan，571737)

Several cellulose degrading-bacteria were isolated form naturally fermented bagasse at different stages using multiple selective media.Strain c1g3-3，which had the capability of degrading cellulose of bagasse，was obtained through preliminary and secondary screenings，as well as the optimal PCS medium.Strain c1g3-3 was identified as Achromobacter xylosoxidans according to its morphology，physiology，bio-chemical and molecular characteristics.

bagasse;cellulose;functional degrading-bacteria

Q939.97

A

1005－7021(2011)01－0039－04

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2008hzslJ021，2009hzs1J033)

賀軍軍男，研究實(shí)習(xí)員。研究方向?yàn)橘Y源開發(fā)與利用。Tel:0759-2192696，E-mail:hbj46@163.com

*通訊作者。Tel:0759-2192696，E-mail:qinfenli@sina.com

2010-12-15;

2011-01-25