苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的研究

張麗艷，王玉田，耿麗晶

(遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001)

苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的研究

張麗艷，王玉田*，耿麗晶

(遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121001)

研究苦瓜總皂甙的抑菌作用及抑菌條件。以苦瓜正丁醇浸提物為原料，研究其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯，最低抑菌濃度為30 mg/mL;抑菌最適pH值范圍5～8;苦瓜總皂甙的熱穩(wěn)定性好，在121℃處理10 min仍具有較好的抑菌活性。金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線表明，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌對(duì)苦瓜總皂甙較敏感，而對(duì)接近穩(wěn)定期的菌體抑制作用較弱。

皂甙;金黃色葡萄球菌;抑菌作用

苦瓜(Momordica charantia L.)為葫蘆科苦瓜屬植物，性味苦寒，具有清熱解毒、滋養(yǎng)強(qiáng)壯、降血糖等功效［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，苦瓜具有降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用。國內(nèi)外研究已證實(shí)，苦瓜汁具有免疫調(diào)節(jié)、廣譜抗菌作用，苦瓜提取液對(duì)細(xì)菌具有抗菌作用，苦瓜種仁蛋白對(duì)啤酒酵母菌、米曲霉菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均有明顯抑制效應(yīng)［2-4］。為進(jìn)一步開發(fā)利用這一資源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)苦瓜浸出汁的抑菌效果進(jìn)行研究，為其作為天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L;牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L。

1.1.3 試劑磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸，分析純度。

1.1.4 儀器與設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;冷凍干燥機(jī)，北京瑞幫興業(yè)科技有公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠; 723A可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乙醇浸提物苦瓜(市售)洗凈，去籽，切片，曬干，粉碎后過40目篩得苦瓜粉。以80%的乙醇，料液比1∶15，60℃浸提2.5 h，5000 r/min離心15 min取上層清液，減壓濃縮，真空冷凍干燥得乙醇浸提物。

1.2.2 苦瓜總皂甙制備［5］苦瓜乙醇浸提液，配制成濃度為100 mg/mL的溶液，加入5%的氫氧化鈉，攪拌使溶解;加入1.25倍量水飽和正丁醇動(dòng)態(tài)萃取2次，分取正丁醇液;加5%氫氧化鈉溶液1倍量，動(dòng)態(tài)洗滌1次，分取正丁醇液;加水1倍量，動(dòng)態(tài)洗滌2次并調(diào)節(jié)溶液pH至中性，分取正丁醇液，即苦瓜總皂甙溶液，備用。

1.2.3 菌懸液的制備［6］金黃色葡萄球菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水分別將各新鮮平板培養(yǎng)物洗下，以無菌生理鹽水配制成吸光度值OD600=0.1菌懸液，使用時(shí)稀釋10倍。

1.2.4 濾紙片法測(cè)定抑菌效果實(shí)驗(yàn)取苦瓜總皂甙溶液，用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的小圓濾紙片，干熱滅菌后，在無菌操作下，將濾紙片放入樣液中，浸泡0.5～1 h。吸取100 μL菌懸液與45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基15 mL混合搖勻，倒入培養(yǎng)皿中冷卻制成含菌平板。再將含有樣液的濾紙片瀝水，微干后均勻鋪在含菌平板表面，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.5 試管法檢測(cè)最低抑菌濃度(MIC)將滅菌后的苦瓜總皂甙溶液用無菌LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配置成系列濃度稀釋液，同時(shí)用生理鹽水做空白對(duì)照，然后在無菌操作條件下，接種對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌液20 μL，搖勻，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.6 抑菌活性的穩(wěn)定性通過對(duì)苦瓜總皂甙抑菌活性的穩(wěn)定性研究，為其應(yīng)用提供一定依據(jù)。本試驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌作為指示菌，測(cè)定了不同的時(shí)間、pH值、溫度等對(duì)苦瓜總皂甙抑菌功能的影響。

1.2.7 抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)［7］金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用LB營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將其稀釋成含菌體107個(gè)/mL，于37℃，150 r/min培養(yǎng)36 h，每隔2 h取樣測(cè)OD值，繪制對(duì)照組生長(zhǎng)曲線;再取一定量對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌加入到含苦瓜總皂甙溶液的LB培養(yǎng)基中，使含菌體107個(gè)/mL，繼續(xù)培養(yǎng)并每隔2 h取樣測(cè)OD值，制作出苦瓜總皂甙作用后的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(λ=600 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜總皂甙抑菌效果

將無菌濾紙片分別放入乙醇浸提液、正丁醇浸提液中進(jìn)行抑菌效果實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用正丁醇飽和水溶液和檸檬酸做對(duì)照，見圖1。由圖1可知，正丁醇飽和水溶液對(duì)金黃色葡萄球菌無抑制作用，正丁醇浸提液的抑菌效果優(yōu)于乙醇浸提液，但比檸檬酸的抑菌作用弱。這表明正丁醇提取液中苦瓜皂甙濃度高，且純度高。

圖1 苦瓜總皂甙抑菌效果實(shí)驗(yàn)Fig.1Bacteriostasis tests of total saponins from Momordica charantia L.

2.2 苦瓜總皂甙最小抑菌濃度

苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果見表1。由表1可知，苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯，最低抑菌濃度為30 mg/mL。

2.3 苦瓜總皂甙抑菌曲線［8］

取含有高濃度苦瓜總皂甙溶液的培養(yǎng)基，在37℃的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，分別在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h取樣測(cè)活菌數(shù)，用含有生理鹽水的培養(yǎng)基做空白對(duì)照，結(jié)果見圖2。未加苦瓜皂甙的對(duì)照組金黃色葡萄球菌保持原有菌數(shù)，并略有增長(zhǎng)。加入苦瓜皂甙的實(shí)驗(yàn)組中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)下降，24 h后活菌數(shù)接近零，即菌體基本被抑制。

表1 苦瓜總皂甙最小抑菌濃度(MIC)Table 1The MIC of total saponins from Momordica charantia L.

圖2 苦瓜總皂甙的抑制曲線Fig.2Bacteriostatic curve of total saponinsfrom Momordica charantia L

2.4 pH值對(duì)苦瓜總皂甙抑菌活性的影響［9］

取制備好的正丁醇浸提液，用不同pH值的緩沖液將其稀釋成質(zhì)量濃度為樣品液1/10的溶液，用乳酸和NaOH調(diào)節(jié)各溶液的pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，并以不同pH值的緩沖溶液生理鹽水為對(duì)照，靜置24 h后，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測(cè)定其抑菌效力。由表2可知，苦瓜總皂甙在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境下幾乎無抑菌作用;在弱酸性條件下，抑菌效果不明顯;在中性和弱堿性條件下，有較強(qiáng)的抑菌作用;苦瓜總皂甙抑菌pH值范圍是5～8。

2.5 溫度對(duì)苦瓜總皂甙抑菌作用的影響

把苦瓜總皂甙溶液置于電熱恒溫箱中，并分別在0、10、30、60、80、100℃這6個(gè)溫度下保溫，并在－20℃和121℃濕熱條件下各處理10 min，紫外燈下殺菌25 min，用原液作對(duì)照，以抑菌圈直徑為指標(biāo)判定處理前后樣品的抑菌效力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，結(jié)果見圖3。苦瓜總皂甙經(jīng)不同溫度處理后其抑菌效果差別不大，基本保持原有的抑菌效力，表明苦瓜總皂甙的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性。

表2 pH值對(duì)苦瓜總皂甙抑菌活性的影響Table 2Effect of pH on total saponins from Momordica charantia L.activity

圖3 溫度對(duì)苦瓜總皂甙抑菌作用的影響Fig.3Effect of temperature on total saponins from Momordica charantia L.activity

2.6 苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線見圖4。由圖4可見，加藥組生長(zhǎng)曲線有明顯變化，細(xì)菌不能達(dá)到正常的生長(zhǎng)高峰進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)菌體培養(yǎng)一段時(shí)間后，在延遲期菌體濃度保持不變且延遲期時(shí)間延長(zhǎng)，表明苦瓜總皂甙對(duì)延遲期的菌體代謝可能有抑制作用;在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度略有上升，且短時(shí)間內(nèi)其抑菌速率迅速增加;在穩(wěn)定期，隨著苦瓜總皂甙作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌作用變?nèi)?，表明?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌可能對(duì)苦瓜總皂甙較敏感，而對(duì)接近穩(wěn)定期的金黃色葡萄球菌抑制作用較弱。

圖4 苦瓜總皂甙對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4Effect of total saponins from Momordica charantia L.on growth curve of Staph.aureus

3 結(jié)論

苦瓜總皂甙作為天然植物食品防腐劑，其抑菌效果稍差于化學(xué)防腐劑，最低抑菌濃度為30 mg/mL，有較好的熱穩(wěn)定性，對(duì)弱酸、弱堿性食品同樣適用。本文通過觀察加藥組金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線可知，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌可能對(duì)苦瓜總皂甙較敏感，而對(duì)接近穩(wěn)定期的金黃色葡萄球菌抑制作用較弱，由于它無毒無副作用，對(duì)人體又有一定的保健作用，因而具有很高的實(shí)用價(jià)值。

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Bacteriostatic Activity of Total Saponins from Balsam Pear(Momordica charantia)against Staphylococcus aureus

ZHANG Li-yan，WANG Yu-tian，GENG Li-jing
(Coll.of Food Sci.＆Technol.，Liaoning Med.Uni.，Jinzhou 121001)

Bacteriostatic effect and condition of total saponins(Ts)from balsam pear(Momordica charantia)(Mc) against Staphylococcus aureus(Sa)was studied.The results indicated that Ts from Mc had obvious bacteriostatic effect against Sa and the minimum inhibitory concentration(MIC)was 30 mg/mL;and the best bacteriostasis pH was 5～8，also thermost ability of Ts from Mc was good;it maintained fairly good antimicrobial activity after treated for 10 min at 121℃of processing.Growth curve of Sa indicated that logarithmic growth phase of Sa sensitive to the saponins，while fairly weak when it close to stable stage.

saponins;Staphylococcus aureus;bacteriostatic effect

TS202.3

A

1005－7021(2011)01－0047－04

遼寧省工程中心基金(2010402004)

張麗艷女，碩士研究生。主要研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品質(zhì)量與安全工程。E-mail:zhangliyan709@163.com

*通訊作者。Tel:0416-4672399，E-mail:wangyutian@163.com

2010-12-20;

2011-01-14