1株近平滑假絲酵母的分離及其鑒定

潘欣

(成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，四川成都610059)

1株近平滑假絲酵母的分離及其鑒定

潘欣

(成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，四川成都610059)

采用平板稀釋法從土壤及水果中分離出1株近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)，YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母，利用分子生物學(xué)方法對其rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(ITS區(qū))進(jìn)行了克隆測序，并與GenBank中已有的有關(guān)序列進(jìn)行比較及系統(tǒng)發(fā)育分析。測序結(jié)果表明該序列長度為547 bp，與GenBank中近平滑假絲酵母同源率在98.5%～100%之間，進(jìn)化分析表明與C.parapsilosis(EF193067)、C.parapsilosis UOA/HCPF(FJ872013)屬于一單獨(dú)分支中，形態(tài)結(jié)果及分子鑒定表明近平滑假絲酵母培養(yǎng)成功，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

近平滑假絲酵母;分離;鑒定;進(jìn)化樹

近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)，屬假絲酵母屬，可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如還原型谷胱甘肽(GSH)［1］、氧化還原酶［2］及木糖還原酶［3］等，是具有催化［4］、消旋轉(zhuǎn)化能力的菌株［5］，也可作為發(fā)酵劑用于肉制品發(fā)酵［6］，因此具有很好的發(fā)展前途。目前，國內(nèi)外對近平滑假絲酵母的研究不多，主要集中在其產(chǎn)生還原酶等生物催化劑方面，對其分子鑒定、進(jìn)化關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育研究較少。鑒于此，本研究從土壤及水果中分離得到1株近平滑假絲酵母，并對其培養(yǎng)特性、細(xì)胞特征進(jìn)行了描述，提取了總DNA，結(jié)合分子生物學(xué)方法對近平滑假絲酵母進(jìn)行鑒定，并作了系統(tǒng)發(fā)育分析，以期為近平滑假絲酵母的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種近平滑假絲酵母純化菌種CP1215，分離自成都理工大學(xué)校園土壤。

1.1.2 試劑Taq DNA聚合酶、dNTP、pBS-TⅡ快速連接試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;IPTG、X-gal、氨芐青霉素，上海生物工程有限責(zé)任公司;分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2000，寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基:蛋白胨2%，酵母抽提物1%，葡萄糖2%，pH自然，制成斜面或平板，加2%瓊脂粉制成YPD固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min備用，冷卻至50℃左右加氨芐西林至終濃度100 μg/mL;LB培養(yǎng)基:蛋白胨1%，酵母抽提物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，加2%的瓊脂制成斜面或平板，121℃滅菌20 min備用，冷卻至50℃左右加氨芐西林至終濃度100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 近平滑假絲酵母分離與純化土壤(10份)取自成都理工大學(xué)校園，將新鮮土壤樣品5 g放入100 mL無菌三角瓶內(nèi)，加入無菌水及玻璃珠，制成10－1～10－8的土壤懸液。用微量移液器吸取0.5 mL土壤稀釋液于YPD培養(yǎng)皿中，將接種物均勻涂布，于28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)5～7 d。水果(10份)購自成都理工大學(xué)菜市場，切成0.5 cm×0.5 cm小塊，接入YPD培養(yǎng)皿。待長出菌落后，在菌落邊緣用無菌接種環(huán)挑取菌落，移入新YPD培養(yǎng)皿中，繼續(xù)于28℃恒溫條件下培養(yǎng)，待長出菌落后顯微鏡觀察顯微特征。

1.2.2 近平滑假絲酵母培養(yǎng)收集將純化后的近平滑假絲酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 d，10000 r/min離心20 min收集細(xì)胞，用吸水紙盡量吸干水分，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA的提取將酵母細(xì)胞用蒸餾水洗滌2次后，用等體積玻璃珠裂解液重懸，渦旋混勻15 min，5%蝸牛酶37℃搖床孵育3 h，1%SDS、100 μg/mL蛋白酶K，37℃水浴30 min，酚-氯仿抽提2次取上清，加入2倍體積75%乙醇沉淀DNA，100%乙醇洗滌，晾干后用超純水溶解DNA，提取的DNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增及克隆采用真菌通用引物ITS4和ITS5，由上海生工生物工程有限公司提供，其序列如下:ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS5(5'-TTGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG)。PCR擴(kuò)增體系50 μL:超純水41 μL，10×Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)5.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，引物各1.0 μL，模板DNA 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收，按pBS-TⅡ快速連接試劑盒步驟轉(zhuǎn)化，將陽性轉(zhuǎn)化子穿刺LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5 ITS區(qū)序列的分析利用Cluster W軟件對ITS序列進(jìn)行整理，DNAstar及Blast(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 近平滑假絲酵母的培養(yǎng)特性

28℃下YPD培養(yǎng)基上，菌株CP1215產(chǎn)生的菌落粘稠、污白色，顯微鏡下為單細(xì)胞個(gè)體，呈球形、橢圓形等，未見芽殖及假絲菌(圖1)。

圖1 近平滑假絲酵母細(xì)胞形態(tài)(100×)Fig.1The morphology of C.parapsilosis cells(100×)

2.2 近平滑假絲酵母ITS區(qū)序列

電泳結(jié)果顯示，近平滑假絲酵母CP1215 ITS區(qū)長度約550 bp左右(圖2)，測序結(jié)果表明該序列長度為547 bp(圖3)，GC%=40.04%，而Gen-Bank中該序列長度在544～548 bp之間，GC%含量在40.11%～40.44%之間。近平滑假絲酵母ITS區(qū)與GenBank中登錄的已知菌株C.parapsilosis wb176(AF455530)，C.parapsilosisMCCC2E00272(EF193067)，C.parapsilosisIFM 52623(AB109289)，C.parapsilosisHK31d (EF198017)，C.parapsilosisUOAHCPF (FJ872013)，C.parapsilosis IFM 2465(AB109235)及C.parapsilosis IFM 2466(AB109292)同源率在98.5%～100%之間，證明本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)出近平滑假絲酵母。

圖2 ITS區(qū)PCR電泳Fig.2Electrophoresis of ITS PCR product

2.3 近平滑假絲酵母CP1215 ITS區(qū)系統(tǒng)發(fā)育分析

選用DNA純度符合要求的總DNA作為模板擴(kuò)增其ITS區(qū)，回收PCR產(chǎn)物作連接、轉(zhuǎn)化及鑒定后測序，選取C.parapsilosiswb176 (AF455530)、C.parapsilosisMCCC2E00272 (EF193067)、C.parapsilosisIFM52623 (AB109289)、C.parapsilosisHK31d (EF198017)、C.parapsilosisUOA/HCPF (FJ872013)、C.parapsilosisIFM2465 (AB109235)及C.parapsilosisIFM2466 (AB109292)等作分析比較。將所得出的近平滑假絲酵母的ITS區(qū)序列分別與GenBank中已有的序列進(jìn)行比較，利用分子生物學(xué)軟件分析構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看到，本試驗(yàn)所得菌株與GenBank中近平滑假絲酵母同源率在98.5%～100%之間。

3 討論

艾麗靜［1］曾用18S rDNA鑒定產(chǎn)還原型谷胱甘肽酵母菌，其與GenBank中菌株同源性為99.75%，本研究表明其與C.parapsilosis (EF193067)、C.parapsilosisUOA/HCPF (FJ872013)屬于一單獨(dú)分支中，而此進(jìn)化關(guān)系與其代謝產(chǎn)物之間是否存在聯(lián)系，尚需下一步研究分析。已有研究表明近平滑假絲酵母是合成手性化合物的重要生物催化劑來源菌株［7］。本研究結(jié)果證明ITS區(qū)序列分析可以作為假絲酵母類真菌的新的鑒定方法，與經(jīng)典形態(tài)學(xué)方法結(jié)合，為近平滑假絲酵母的分類鑒定及進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

［1］艾麗靜，饒志明，沈微，等.產(chǎn)還原型谷胱甘肽酵母菌的篩選與初步鑒定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(3):18-21.

［2］張榮珍.近平滑假絲酵母立體選擇性還原酶表達(dá)、結(jié)構(gòu)解析與改造［D］.江南大學(xué)博士論文，2009.

［3］曲有鵬.近平滑假絲酵母木糖還原酶基因的克隆及表達(dá)研究［D］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.

［4］婁文勇，郭強(qiáng)，郁惠蕾，等.近平滑假絲酵母細(xì)胞催化乙酰基三甲基硅烷不對稱還原反應(yīng)［J］.催化學(xué)報(bào)，2009，30(12): 1276-1280.

［5］任艷秋，徐巖，穆曉清，等.醇類物質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)改善近平滑假絲酵母去消旋轉(zhuǎn)化能力［J］.催化學(xué)報(bào)，2005，5(5):554-557.

［6］趙俊仁，孔保華.自然發(fā)酵風(fēng)干腸中酵母菌生產(chǎn)性能的研究［J］.食品科技，2010，35(10):27-31.

［7］羊明，徐巖，穆曉清，等.近平滑假絲酵母NAD(H)依賴型次級(jí)醇脫氫酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13(1): 121-125.

Isolation，Purification and Identification of a Candida parapsilosis strain

PAN Xin
(Chengdu Uni.of Technol.，Chengdu 610059)

A Candida parapsilosis(Cp)strain was isolated using YPD medium plate dilution method from soil and fruits，identified by molecular biological method with rRNA gene cloning and sequencing in its ITS transcription domain;and made the comparison with relevant sequence available in Genbank and phylogenetic analysis.The results of the sequencing showed that homologous rate of the Cp strain was 98.5%～100%with the one in Genbank.Evolution analysis showed that it belonged to independent branch of Cp(EF193067)and Cp UOA/HCPF(FJ872013).Its morphology and molecular identification indicated that the Cp strain was successfully cultivated and this provided a foundation for its further development and utilization.

Candida parapsilosis;isolation;identification;phylogenetic tree

Q939.5，Q812

A

1005－7021(2011)01－0043－04

潘欣女，博士，講師。主要從事真菌及生態(tài)學(xué)的研究。E-mail:zoulk124@163.com

2011-01-04;修回日期:2011-01-23