抗癌鎮(zhèn)痛肽AGAP肺靶向融合體在畢赤酵母中的表達(dá)

馬建榮，余永紅，張景海

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東廣州510520;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016)

抗癌鎮(zhèn)痛肽AGAP肺靶向融合體在畢赤酵母中的表達(dá)

馬建榮1，余永紅1，張景海2*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，廣東廣州510520;2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016)

利用構(gòu)建好的質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP(analgesic-antitumor peptide，抗癌鎮(zhèn)痛肽)進(jìn)行單酶切線性化，然后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，電轉(zhuǎn)之后的菌落通過(guò)菌落PCR進(jìn)行篩選，最終得到陽(yáng)性菌落。陽(yáng)性菌落經(jīng)增菌培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)后的上清SDS-PAGE電泳后經(jīng)western blot檢測(cè)證明，抗癌鎮(zhèn)痛肽肺靶向融合體已經(jīng)成功得到表達(dá)。

東亞鉗蝎;抗癌鎮(zhèn)痛肽;畢赤酵母;真核表達(dá)

蝎毒種類多，相對(duì)分子量小、穩(wěn)定性好、活性強(qiáng)，具有廣泛的生物學(xué)作用［1］。蝎毒蛋白一般是由20～80個(gè)氨基酸組成的多肽。AGAP是劉巖峰、張景海［2］于2003年由蝎毒中提取的具有抗腫瘤和鎮(zhèn)痛活性的活性多肽，并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在大腸埃希菌中的表達(dá)。但是在其表達(dá)中仍存在一些問(wèn)題，例如分離純化過(guò)程復(fù)雜，需要去除內(nèi)毒素，活性受到一定影響等。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，且具有易于高密度發(fā)酵，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動(dòng)子AOX1，用該系統(tǒng)成功表達(dá)的外源基因有30多種，其中大部分為醫(yī)藥制品，如人白介素-2、人血清白蛋白、腫瘤壞死因子、乙肝表面抗原、人巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus)抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物(hirudin variants)、血管緊張肽-Ⅰ轉(zhuǎn)換酶等，有些即將進(jìn)入市場(chǎng)［3-4］，證實(shí)該系統(tǒng)為高效、實(shí)用、簡(jiǎn)便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模。與大腸埃希菌的表達(dá)相比，畢赤酵母具有利于蝎毒蛋白正確折疊、分離純化簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究擬實(shí)現(xiàn)抗癌鎮(zhèn)痛肽AGAP 肺靶向融合體在畢赤酵母中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP、大腸埃希菌BL-21，沈陽(yáng)藥科大學(xué)構(gòu)建保藏;畢赤酵母GS115，invitrogen公司;各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Taq酶及PCR反應(yīng)緩沖液，TaKaRa(Japan)公司; Western Blot中使用的抗體(兔抗)，本實(shí)驗(yàn)室制備保存;堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)-Alkaline Phosphatase Goat Anti-Rabbit IgG(H+ L)，北京中杉生物公司;顯色液BCIP/NBT(0.48 mmol/L和0.51 mmol/L)，Amresco產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化線性化的質(zhì)粒與酵母基因組更容易發(fā)生重組整合，因此載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP首先進(jìn)行SacⅠ單酶切，成為帶有2個(gè)粘性末端的線性分子，以便轉(zhuǎn)入畢赤酵母后與基因組同源重組。

1.2.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化步驟參考MicroPulserTM Electroporation Aparatus Operating Instructions and Applications Guide(MicroPulser TM電穿孔儀操作說(shuō)明和應(yīng)用指導(dǎo)，BIO-RAD)。

1.2.3 克隆篩選菌落PCR:用牙簽挑取轉(zhuǎn)化平板上長(zhǎng)出的單菌落，涂抹到200 μL離心管底，微波1 min;－80℃凍5 min，再微波1 min。加入20 μL無(wú)菌水溶解，離心后取1～2 μL上清做模板，配制50 μL PCR體系。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot檢測(cè)挑取克隆篩選得到的陽(yáng)性菌落于25 mL BMGY(Buffered glycerol complex medium)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)至OD600≈4.1。離心、收集菌體，用100 mL BMMY (Buffered methanol complex medium)培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。每日取樣1 mL，并補(bǔ)加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為1%，誘導(dǎo)表達(dá)6 d，取樣品加入2×SDS上樣緩沖液在100℃沸水中變性處理3～5 min，離心去沉淀后，用于Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%分離膠80 V，5%積層膠120 V)。SDS-PAGE分離后，用電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至預(yù)處理的PVDF膜上，恒壓94 V，轉(zhuǎn)移30 min。取出PVDF，用蒸餾水漂洗5 min，將膜置于封閉緩沖液(TBST+5%BSA)中，室溫輕搖2.5 h，取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。1∶100加入一抗，4℃過(guò)夜反應(yīng)。取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。1∶1000加入二抗(堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG)，室溫輕搖2 h。取出，用TBST漂洗3次，每次5 min。加入顯色液BCIP/NBT，不斷搖動(dòng)，直到顯出顏色條帶，用蒸餾水漂洗中止染色［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化

如圖1所示，右側(cè)泳道樣品為表達(dá)載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP，由于正/負(fù)超螺旋和線型分子的泳動(dòng)速度不同而呈現(xiàn)多條譜帶，中間泳道為表達(dá)載體pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP雙酶切后解除正/負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，成線性，所以只有一條譜帶出現(xiàn)。

圖1 質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP線性化結(jié)果Fig.1Enzyme digestion of pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP Electrophoresis type is 1.0%agarose gel;Lane 1 is marker λDNA Hind III;Lane 2 is pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP digested by Sac I;Lane 3 is undigested pPIC9K-RGD-4CHis Tag-AGAP電泳采用1.0%的瓊脂糖凝膠，1:分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA Hind III;2:經(jīng)Sac I消化后的質(zhì)粒RGD-4C-His Tag-AGAP;3:未經(jīng)消化的RGD-4C-His Tag-AGAP

2.2 克隆篩選

分別以菌落處理后的上清、pPIC9K轉(zhuǎn)化的畢赤酵母處理后的上清和質(zhì)粒pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP為模板進(jìn)行PCR，作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。電泳觀察結(jié)果。如圖2所示:A、B、C、D 4個(gè)菌株與陽(yáng)性對(duì)照相同位置均有條帶，為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的western blot檢測(cè)

以菌液誘導(dǎo)后上清為樣品，以pPIC9K轉(zhuǎn)化的菌液誘導(dǎo)后上清為陰性對(duì)照，以原核表達(dá)的RGD-4C-His Tag-AGAP蛋白作為陽(yáng)性，進(jìn)行SDSPAGE電泳，9 V轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜30 min，BICP/ NBT顯色觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖3所示，樣品在與陽(yáng)性對(duì)照相同位置有條帶，證明RGD-4C-His Tag-AGAP在畢赤酵母中得到成功表達(dá)。

3 討論

酵母作為單細(xì)胞真核生物，易于培養(yǎng)，生長(zhǎng)繁殖速度快，具有比大腸埃希菌更加完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、基因表達(dá)產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境以及對(duì)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力。尤其是釀酒酵母，其基因測(cè)序已經(jīng)于1996年完成，而且安全性高，因此酵母作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)得到廣泛的研究和應(yīng)用。

Shao等［6］在釀酒酵母中成功表達(dá)了來(lái)源于東亞鉗蝎的哺乳動(dòng)物神經(jīng)毒素BmK M1，并且分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平達(dá)到5 mg/L發(fā)酵液。雖然跟天然BmK M1相比，重組BmK M1在N端有2個(gè)額外的氨基酸殘基，但是并沒(méi)有影響活性。相比之下，當(dāng)沒(méi)有額外的氨基酸存在時(shí)，表達(dá)極不穩(wěn)定。這種酵母表達(dá)蝎毒素基因工程產(chǎn)物時(shí)信號(hào)肽切除不完全的現(xiàn)象在Pang等［7］將化學(xué)合成的抗昆蟲毒素短肽BeI5A的基因轉(zhuǎn)入酵母菌中時(shí)就曾經(jīng)有過(guò)。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有大量外源蛋白質(zhì)合成時(shí)，酵母氨肽酶的活力不足以切除它們氨基末端多余的氨基酸殘基，酵母的自身平衡調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，就會(huì)出現(xiàn)信號(hào)肽切除不完全現(xiàn)象。

除了上述基因外，在釀酒酵母中表達(dá)的重組蝎毒素基因還有昆蟲特異性蝎神經(jīng)毒素AaH IT1［8］。但是只有很小的一部分重組蛋白被釋放到培養(yǎng)基中。這也是由于釀酒酵母的分泌效率不太高造成的。而且釀酒酵母缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，不適合高密度培養(yǎng)。

當(dāng)利用釀酒酵母制備時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果很令人鼓舞，但由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，其產(chǎn)量迅速下降。原因是培養(yǎng)基中維持質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降?？截悢?shù)是高效表達(dá)的必備因素，因此拷貝數(shù)下降，也直接導(dǎo)致外源基因表達(dá)量的下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基成分復(fù)雜且昂貴，當(dāng)采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時(shí)，導(dǎo)致了產(chǎn)量的下降。有鑒于此，人們發(fā)展了新一代的酵母表達(dá)系統(tǒng)—巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)，即甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)［9］。

甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括:Pichia、Candida等，以Pichia pastoris(巴斯德畢赤酵母)為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛，已利用此系統(tǒng)表達(dá)了一系列有重要生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)［10-12］:具有目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子;表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合;菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高;存在過(guò)氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。

Pichia pastoris酵母菌體內(nèi)無(wú)天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)［13］，包括啟動(dòng)子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸埃希菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌至胞外，表達(dá)載體還需帶有信號(hào)肽序列。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有多種分泌型表達(dá)質(zhì)粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了高效分泌表達(dá)［14-16］。胞外表達(dá)需要在外源蛋白的N末端添加一段信號(hào)肽序列，引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入分泌途徑，可使蛋白質(zhì)在分泌到胞外之后獲得準(zhǔn)確的構(gòu)型。本課題采用的就是畢赤酵母分泌性表達(dá)載體pPIC9K。成功實(shí)現(xiàn)了抗癌鎮(zhèn)痛肽肺靶向融合體在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。目前國(guó)外尚無(wú)蝎毒在畢赤酵母中成功表達(dá)的報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅有2篇文獻(xiàn)報(bào)道已成功表達(dá)蝎毒蛋白［17-18］，但尚無(wú)人報(bào)道成功表達(dá)AGAP。本研究的成功對(duì)以后蝎毒在畢赤酵母中表達(dá)研究具有重要意義。

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Expression of a Lung Targeted Fusion Protein AGAP in Pichia pastoris

MA Jian-rong1，YU Yong-hong1，ZHANG Jing-hai2
(1.Exp.Ctr.，Guangdong Food and Drug Vocat’l Coll.，Guangzhou 510520; 2.Sch.of Life Sci.＆Biopharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang 110016)

A constructed plasmid pPIC9K-RGD-4C-His Tag-AGAP(analgesic-antitumor peptide)was linearized with single enzyme digestion and electroporation transformed into Pichia pastoris GS115，the transformed colonies were screened through colony PCR and finally obtained positive ones.And they were proliferated，and the supernatant SDSPAGE after induced with methanol and tested proved with western blot that fusion protein of lung targeted RGD-4C-His Tag-AGAP was expressed successfully.

East Asian pincers scorpion(Buthus martensii Karsch);AGAP;Pichia pastoris;eukaryotic expression

Q786

A

1005－7021(2011)01－0015－04

國(guó)家自然科學(xué)基金(30772738);沈陽(yáng)市科技局沈陽(yáng)市藥學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基金(1081102-1-00)

馬建榮女，碩士。從事生物技術(shù)和生物信息學(xué)等方面研究。Tel:020-28854174，E-mail:ma_jianrong@yahoo.com.cn

*通訊作者。Tel:024-23986431，E-mail:Jinghaizhang2000@yahoo.com.cn

2010-10-26;

2011-01-20