三聚氰胺在大菱鲆體內(nèi)的代謝消除規(guī)律研究

邢麗紅, 孫偉紅, 苗鈞魁, 譚志軍, 翟毓秀, 冷凱良

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071）

三聚氰胺在大菱鲆體內(nèi)的代謝消除規(guī)律研究

邢麗紅, 孫偉紅, 苗鈞魁, 譚志軍, 翟毓秀, 冷凱良

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071）

采用LC-MS/MS法研究三聚氰胺在大菱鲆（Scophthalmus maximus）體內(nèi)的代謝消除規(guī)律。三聚氰胺以5 g/kg濃度添加到飼料中, 連續(xù)投喂大菱鲆30 d, 停藥后, 對(duì)大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟組織殘留的三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明: 三聚氰胺能夠在大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟各組織中富集并消除, 最高血藥濃度由高到低依次為Cmax肝臟＞Cmax腎臟＞Cmax肌肉, 藥時(shí)曲線下面積 AUC肝臟＞AUC腎臟＞AUC肌肉, 三聚氰胺在腎臟中消除最快, 肝臟次之, 肌肉最慢。停止給藥30 d后, 肌肉中三聚氰胺的含量降至檢出限以下。建議在本實(shí)驗(yàn)條件下, 三聚氰胺在肌肉中的代謝周期為40 d。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）; 三聚氰胺; 代謝; 消除

2007年 3月以來(lái), 美國(guó)相繼發(fā)生多起貓狗死亡事件, 美國(guó)食品藥品管理局（FDA）調(diào)查發(fā)現(xiàn), 寵物食品使用的小麥蛋白粉和大米蛋白粉中含有的三聚氰胺是導(dǎo)致寵物致死的原因, 2008年9月國(guó)內(nèi)繼而又發(fā)生了三鹿奶粉事件, 引起了國(guó)內(nèi)外對(duì)三聚氰胺的高度關(guān)注。

三聚氰胺簡(jiǎn)稱(chēng)三胺, 是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料, 其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基氮, 添加到動(dòng)、植物蛋白制品中可以提高表觀氮含量或以凱氏定氮法所測(cè)的蛋白質(zhì)含量。關(guān)于三聚氰胺的檢測(cè)方法, 目前主要有氣相色譜法[1]、氣相色譜-質(zhì)譜法[2-3]、高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法不但具有較高的靈敏度, 又不需要衍生,操作較簡(jiǎn)便, 可作為理想的確證方法而得到廣泛應(yīng)用。

關(guān)于三聚氰胺的研究, 在檢測(cè)方法、藥理毒理學(xué)方面均有相關(guān)報(bào)道[10-13], 目前已有三聚氰胺在雞、雞蛋和豬體內(nèi)的代謝消除規(guī)律研究[14-16], 但三聚氰胺在水生生物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)方面的報(bào)道卻很少。本文通過(guò)在飼料中添加一定濃度的三聚氰胺, 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三聚氰胺的殘留量, 研究其在大菱鲆體內(nèi)的代謝過(guò)程, 為防范三聚氰胺殘留提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%, 美國(guó) Sigma 公司）; 氘代三聚氰胺（100 μg/mL, 美國(guó) Sigma公司）;三聚氰胺原藥、三氯乙酸、氨水、乙酸銨（均為分析純）; 二氯甲烷、乙腈、甲醇（均為分析純）; Oasis MCX固相萃取柱（60 mg, 3 mL）。

1.2 儀器

Thermo TSQ Quantum Access 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀, 高速離心機(jī), 超聲波清洗儀, 氮吹儀, 固相萃取裝置, 旋渦振蕩器等。

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱: CAPCELL PAK CR （2.0 ×150 mm, SCX:C18=1 : 4, 5 μm）; 進(jìn)樣量: 10 μL; 柱溫: 室溫; 流動(dòng)相: 20 mmol/L乙酸銨: 乙腈=1 : 1（V/V）, 用乙酸調(diào)至pH=3.0; 流速: 0.2 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子化模式: 大氣壓電噴霧離子源（ESI）, 正離子模式; 噴霧電壓: 4 500 V; 鞘氣壓力: 12 L/min; 輔助氣流量: 2 L/min; 離子傳輸毛細(xì)管溫度: 350 ℃;源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓: 6 V; 掃描模式: 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）, 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表1。Q1半峰寬: 0.7 Da; Q3半峰寬: 0.7 Da; 碰撞氣壓力: 氬氣, 1.5 mTorr。

表1 三聚氰胺的質(zhì)譜條件Tab. 1 ESI MS/MS set up for melamine analysis

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

健康大菱鲆（Scophthalmus maximus）, 平均體質(zhì)量 0.05 kg, 試驗(yàn)前檢測(cè)表明大菱鲆各組織中無(wú)三聚氰胺殘留。試驗(yàn)前將大菱鲆暫養(yǎng)于清潔、充氣和循環(huán)海水的養(yǎng)殖桶內(nèi), 試驗(yàn)期間溫度控制在16℃±3 ℃,每日投喂新鮮、不含任何藥物的飼料。

1.4 三聚氰胺藥代動(dòng)力學(xué)和殘留實(shí)驗(yàn)給藥方法

實(shí)驗(yàn)前將大菱鲆隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組,分別編號(hào)、稱(chēng)質(zhì)量記錄。實(shí)驗(yàn)組三聚氰胺的添加濃度為5 g/kg, 稱(chēng)取適量三聚氰胺, 將其和粉末狀飼料充分?jǐn)嚢杈鶆? 再制成含三聚氰胺的顆粒飼料。然后將藥物飼料連續(xù)投喂 30 d, 進(jìn)行三聚氰胺的富集實(shí)驗(yàn), 之后改投不含三聚氰胺的飼料, 連續(xù)投喂 40 d,進(jìn)行三聚氰胺的消除實(shí)驗(yàn)。在消除實(shí)驗(yàn)階段, 分別在第 0、2、6、12 h 和 1、2、4、6、9、12、16、20、25、30、35、40 d, 實(shí)驗(yàn)組各采樣點(diǎn)取6尾大菱鲆, 取其肌肉、肝臟、腎臟, 提取殘留的三聚氰胺進(jìn)行測(cè)定。

1.5 三聚氰胺的提取

1.5.1 制樣

取大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟組織, 切成不大于0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm 的小塊, 充分勻漿, 備用。

1.5.2 提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取肌肉2 g（精確到0.01 g）, 加入10 mg/L三聚氰胺內(nèi)標(biāo)100 μL, 加入20 mL1%三氯乙酸, 充分渦旋混合均勻, 超聲20 min, 10 000 r/min離心5 min, 將上清液過(guò)濾。取10 mL過(guò)濾后的上清液, 待凈化。

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取肝臟、腎臟1 g（精確到0.01 g）, 加入10 mg/L三聚氰胺內(nèi)標(biāo)50 μL, 加入5 mL1%三氯乙酸, 5 mL乙腈, 充分渦旋混合均勻, 超聲20 min,10 000 r/min離心5 min, 取上清液于50 mL另一具塞離心管中, 加入15 mL二氯甲烷, 渦旋1 min, 5 ℃下以不低于8 000 r/min離心5 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中, 加入3 mL水于二氯甲烷層中,渦漩1 min, 離心, 5 ℃下以不低于8 000 r/min離心5min。將上清液合并于上述 15 mL離心管中, 渦旋混勻, 待凈化。

1.5.3 凈化

將MCX固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化, 將1.5.2上清液過(guò)柱, 依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗, 抽至近干后, 用 6 mL 5%氨化甲醇洗脫,整個(gè)萃取過(guò)程流速保持每秒一滴。收集洗脫液于 10 mL離心管, 50 ℃下砂浴氮?dú)獯蹈?。殘留物? mL流動(dòng)相定容, 渦旋混合, 過(guò) 0.2 μm有機(jī)相微孔濾膜后, 進(jìn)LC-MS/MS分析。

1.6 工作曲線制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 0.01 g, 用乙腈溶解并定容至10 mL, 配成1 g/L母液。將0.1 g/L氘代三聚氰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用 50%乙腈水溶液稀釋 0.01 g/L中間液。將1 g/L母液三聚氰胺和氘代三聚氰胺內(nèi)標(biāo)溶液用 50%乙腈水溶液稀釋成三聚氰胺的濃度分別為 0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/L, 氘代三聚氰胺內(nèi)標(biāo)濃度為 0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液, 進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定。

1.7 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

在空白大菱鲆肌肉、肝臟、腎臟中分別按照0.1、0.5、1.0 mg/kg的添加水平進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn), 樣品前處理按照1.5進(jìn)行, 每個(gè)添加水平6個(gè)重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理方法

采用DNS 2.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)三種組織中三聚氰胺藥物濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍和最低檢出限

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02 ～2 mg/L濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好, 相關(guān)系數(shù)大于 0.99, 該方法的最低檢出限為0.02 mg/kg。

2.2 回收率與精密度

在本實(shí)驗(yàn)條件下, 以0.1、0.5和1.0 mg/kg 三個(gè)水平分別測(cè)定在肌肉、肝臟和腎臟中的回收率（表2）。三個(gè)組織中的回收率在（84.6±7.4）%～（92.1±8.1）%之間, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

表2 大菱鲆各組織回收率數(shù)據(jù)表（n=6）Tab. 2 Recoveries of melamine for muscle, liver and kidney （n=6）

2.3 三聚氰胺在大菱鲆體內(nèi)的藥-時(shí)曲線（Ci-Ti）圖

大菱鲆連續(xù)投喂三聚氰胺藥餌停藥后, 采用LC-MS/MS法測(cè)定各組織中三聚氰胺的含量, 其肌肉、肝臟、腎臟中的三聚氰胺的殘留量隨時(shí)間變化的藥-時(shí)曲線圖見(jiàn)圖1。

圖1 三聚氰胺在各組織中的藥-時(shí)曲線圖Fig. 1 The drug concentration-time curves of melamine in muscle, liver and kidney

2.4 三聚氰胺的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

DAS 2.0程序可自動(dòng)計(jì)算出藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表3給出了以5 g/kg濃度在飼料中添加三聚氰胺投喂大菱鲆30 d, 停藥后三聚氰胺的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2.5 三聚氰胺的富集和代謝

通過(guò)前期三聚氰胺在大菱鲆體內(nèi)的富集實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 以5 g/kg添加濃度將三聚氰胺添加到飼料中, 三聚氰胺可以富集到大菱鲆體內(nèi), 但不同組織對(duì)三聚氰胺的富集能力不同, 肌肉、肝臟、腎臟中的三聚氰胺含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。富集30 d后, 改投不含三聚氰胺的飼料, 各組織中藥物濃度很快降低,由此表明, 各組織吸收的藥物通過(guò)代謝途徑減少。

通過(guò)在飼料中添加三聚氰胺的方式投喂大菱鲆,停藥后, 各組織中三聚氰胺的含量均較高, 且在各組織中的最高血藥濃度由高到低依次為Cmax肝臟＞Cmax腎臟＞Cmax肌肉。三聚氰胺在各組織中的含量相差很大, 在肌肉中的濃度遠(yuǎn)低于肝臟和腎臟中的濃度,肝臟中Cmax是肌肉中的十多倍, 腎臟中的Cmax是肌肉中的大約 5倍。余曉華等[14]在研究雞體內(nèi)三聚氰胺的殘留及代謝規(guī)律時(shí), 測(cè)定了腎臟、雞肺、肝臟,雞胸肉、雞心、雞油組織, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 三聚氰胺在腎臟中的殘留量最高, 高于其在肝臟中的殘留量。而在豬體內(nèi)三聚氰胺的殘留也表現(xiàn)出相似的規(guī)律, 即腎臟中殘留量最高[16], 與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些差異。

表3 三聚氰胺的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）Tab. 3 The pharmacokinetic parameters of melamin in various tuibot tissues of （n=6）

藥時(shí)曲線下面積（AUC）反應(yīng)藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)藥量的多少, 是一個(gè)衡量藥物在魚(yú)體內(nèi)各組織器官的吸收的重要指標(biāo)。三聚氰胺在大菱鲆三個(gè)組織中AUC 由高到低依次為（表 3）: AUC肝臟＞AUC腎臟＞AUC肌肉。在相同給藥劑量條件下, 各組織的AUC差別很大, 說(shuō)明組織不同, 對(duì)藥物的蓄積能力有很大差別。肝臟的AUC大約是腎臟的3倍, 是肌肉的7倍, 說(shuō)明肝臟對(duì)三聚氰胺的蓄積能力較強(qiáng), 吸收后的藥物大部分蓄積在肝臟組織, 之后緩慢釋放到肌肉、血液等其他組織。

消除相半衰期（t1/2）反映了藥物在機(jī)體內(nèi)的消除速度, 指血藥濃度消除到一半所用的時(shí)間, 是藥動(dòng)學(xué)的一個(gè)重要參數(shù)。不同組織間的t1/2差異較大, 三聚氰胺在大菱鲆肌肉中的消除半衰期為 4.2 d, 在腎臟中的消除半衰期為 1.9 d, 在肝臟中的消除半衰期為 3.1 d, 可見(jiàn)不同組織間的三聚氰胺t1/2差異較大（表 3）, 在腎臟中消除最快, 肝臟次之, 肌肉最慢。Mast等[10]對(duì)成年雄性Fischer 344大鼠研究表明, 三聚氰胺在大鼠體內(nèi)經(jīng)過(guò)第一個(gè)24 h后, 約90%以原形形式從尿中排出, 血漿消除半衰期約 2.7 h, 尿中消除半衰期約 3 h, 二者接近。用含三聚氰胺 200 mg/kg和1 000 mg/kg的飼料投喂蛋雞, 5 d后代謝均較快, 停藥 20 d后各組織中均未檢出三聚氰胺殘留[14]。用含三聚氰胺2.5、100和500 mg/kg的飼料飼喂豬, 食用組織中殘留物需要停藥10 d后才能降至0.5 mg/kg以下[16]。三聚氰胺在大菱鲆體內(nèi)消除速率低于在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的消除速率, 這可能與它們長(zhǎng)期所處的較低的環(huán)境溫度有關(guān)。研究表明, 在一定溫度范圍內(nèi), 藥物的代謝強(qiáng)度與水溫成正比, 水溫越高, 代謝速度越快, 溫度變化 1℃, 藥物代謝速度變化10%[17]。

2.6 代謝周期

目前我國(guó)、歐盟、澳大利亞、新西蘭、加拿大等均規(guī)定嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的最大限量值為 1 mg/kg, 液態(tài)奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的最大限量值為 2.5 mg/kg, 含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的最大限量值為2.5 mg/kg。三聚氰胺在飼料中的最大殘留限量為 2 mg/kg。三聚氰胺在水生生物體內(nèi)的殘留限量還沒(méi)有規(guī)定。對(duì)大菱鲆投喂三聚氰胺飼料30 d后研究其代謝情況, 三聚氰胺在大菱鲆肌肉中的殘留量30 d后降至檢測(cè)限以下, 由于肌肉是可食性組織, 為確保食品安全系數(shù)更高一些, 建議在此實(shí)驗(yàn)條件下, 三聚氰胺在肌肉中的代謝周期為40 d。

[1] 辛若竹, 丁梅, 張新杰, 等．氣相色譜法測(cè)定乳品中三聚氰胺含量的研究[J]．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2009,19（3）: 485-487.

[2] 王征. GC-MS法測(cè)定動(dòng)物食品中的三聚氰胺[J]. 福建分析測(cè)試, 2008, 17（2）: 1-4.

[3] Jonathan J L, Gregory E M, Kevin J M. GC-MS Screen for the Presence of Melamine, Ammeline, Ammelide,and Cyanuric Acid[J]. Laboratory Information Bulletin,2008, 24: 4 423-4 424.

[4] 汪輝、曹小彥, 彭新凱, 等. 高效液相色譜-二極管陣列法測(cè)定高蛋白食品中的三聚氰胺[J]. 食品與機(jī)械,2007, 23（5）: 114-115, 124.

[5] 丁濤, 徐錦忠, 李健忠, 等. 高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法及高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J]. 色譜, 2008, 26（1）:6-9.

[6] 蔡勤仁, 歐陽(yáng)穎瑜, 前貞潔, 等. 超高相液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中殘留的三聚氰胺[J]. 色譜, 2008, 26（3）: 339-342.

[7] Wendy C A, Sherri B T, Christine M K, et al. Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography[J]. Laboratory Information Bulletin, 2007, 23:4 396-4 404.

[8] 劉梅, 李金強(qiáng), 田德金, 等. 固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的三聚氰胺[J]. 化學(xué)分析計(jì)量,2008, 17（2）: 48-50.

[9] 王浩, 劉艷琴, 曹紅, 等. 固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用測(cè)定寵物食品中三聚氰胺[J]. 分析化學(xué), 2008,36（2）: 273.

[10] Mast R W, Jeffcoat A R, Sadler B M, et al. Metabolism,disposition and excretion of [14C]melamine in male Fischer 344 rats[J]. Food Chem Toxicol, 1983, 21（6）:807-810.

[11] 盛夏冰, 羅超, 李俐樺, 等. 三聚氰胺的毒性及其檢測(cè)方法[J]. 飼料博覽（技術(shù)版）, 2009, 7: 27-28.

[12] 劉海燕, 張偉, 薛敏, 等. 三聚氰胺對(duì)吉富羅非魚(yú)的急性毒性研究[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2009, 33（5）: 559-665.

[13] 李友杰, 趙術(shù)燕, 王延華, 等. 動(dòng)物性食品中三聚氰胺殘留的危害及其檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工（創(chuàng)新版）, 2009, 8: 48-52.

[14] 余曉華, 孫澤祥, 呂燕, 等. GC/MS法研究雞體內(nèi)三聚氰胺的殘留及代謝規(guī)律[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 21（4）: 379-384.

[15] 呂燕, 孫澤祥, 楊挺, 等. 雞蛋中三聚氰胺檢測(cè)方法與殘留消除規(guī)律研究[J]. 寧波農(nóng)業(yè)科技, 2009, 3: 2-4.

[16] 孫澤祥, 楊挺, 鮑偉華, 等. 豬雞體內(nèi)三聚氰胺殘留與代謝規(guī)律研究[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊, 2009, 8: 49-50.

[17] Ingebrigtsen K. Factors affecting drug disposition in fish[J]. Acta Vet Scand, 1991, 87: 44-56.

Received: Jan., 06, 2010

Key words:turbot; melamine; metabolism; elimination

Abstract:We studied the metabolism and elimination of melamine in turbots. The melamine was fed to turbot at 5 mg/kg, and the melamine retained in muscle, liver and kidney was determined. The results indicate that melamine can be accumulated and eliminated in turbot muscle, liver, and kidney. The order of maximum residues of melamine from high to low wasCmaxliver＞Cmaxkidney＞Cmaxmuscle, while the area under the curve was AUCliver＞AUCkidney＞AUCmuscle. The elimination speed of melamine in various tissues followed the order of kidney ＞ muscle ＞ liver.Thirty days post the feeding of melamine, the melamine level in muscle was below the detection limit.

（本文編輯:康亦兼）

Metabolism and elimination of melamine in turbot

XING Li-hong, SUN Wei-hong, MIAO Jun-kui, TAN Zhi-jun, ZHAI Yu-xiu, LENG Kai-liang
（Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China）

X171.5

A

1000-3096（2011）01-0066-04

2010-01-06;

2010-06-02

基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2009-CB-02）; 國(guó)家 863計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA100805）

邢麗紅（1981-）, 女, 山東青島人, 主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)及研究, 電話: 0532-85836348, E-mail: xinglh@ysfri.ac.cn; 冷凱良, 通信作者, E-mail: lengkl@ysfri.ac.cn.