非清髓同種異基因小鼠外周血造血干細(xì)胞移植模型的建立及其相關(guān)研究

張 琰,孫 寧,湯唯艷,朱華云,劉雅恬,趙 剛,吳劍秋

(1.江蘇省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科,江蘇南京,210000;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院血液科,江蘇南京,210009)

非清髓異基因外周血造血干細(xì)胞移植(allo-PBSCT)以相對較低的預(yù)處理強(qiáng)度,借助形成混合嵌合體(MC)共刺激達(dá)到雙向耐受,明顯降低了移植相關(guān)并發(fā)癥及死亡率,但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者存活率的主要障礙[1]?；旌锨逗蠣顟B(tài)下的移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)相對較弱,使得移植后復(fù)發(fā)率進(jìn)一步升高。如何在提高嵌合率的同時降低宿主的GVHD發(fā)病率是目前移植研究領(lǐng)域的主要課題。近年來有報道將骨髓干細(xì)胞直接注入骨髓腔內(nèi)明顯促進(jìn)了造血重建,同時降低了GVHD的發(fā)病率。本研究選用了H-2不同的2種品系近交小鼠,通過不同途徑給予非清髓allo-PBSCT,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行淋巴細(xì)胞輸注(DLI),比較經(jīng)尾靜脈與髓腔內(nèi)注射的不同輸注PBSCT對小鼠嵌合率及GVHD發(fā)病率的影響,并對其可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性清潔級BALB/c(H-2d,簡稱BA)作為供體鼠,雌性清潔級C57BL/6(H-2b,簡稱B6)小鼠作為受體鼠,6～8周齡,體質(zhì)量(15.6±1.8)g;由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供,SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2 BALB/c小鼠的動員及細(xì)胞懸液制備

第4天起皮下注射200 μ g/kg重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF,100 μ g/支,齊魯制藥有限公司生產(chǎn)),1次/d,末次注射2～3 h后無菌條件下取靜脈血(EDTA抗凝)并分離脾臟,脾臟剪碎、研磨后制備成脾細(xì)胞懸液。分別加入淋巴細(xì)胞分離液,以2 000 r/min 300 g離心30 min,分離出單個核細(xì)胞(MNC),加入 PBS液(0.01 mmol/L)漂洗2次,調(diào)節(jié)重懸細(xì)胞密度至6×107個/mL。

1.3 移植模型的建立及供鼠淋巴細(xì)胞輸注

第6天起對受鼠進(jìn)行腸道準(zhǔn)備,飲用水中加入慶大霉素(320 mg/L)和紅霉素(250 mg/L),直至移植完成后第3周。d0用特制塑料盒(清潔級包裝)裝入受體鼠,60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)給予5.5 Gy60Coγ全身放射治療(TBI),照射結(jié)束4 h內(nèi)分別經(jīng)尾靜脈及骨髓腔內(nèi)輸注3×107個供鼠的外周血單個核細(xì)胞(PBMNC),d+2腹腔內(nèi)注射CTX 200 mg/kg。供鼠淋巴細(xì)胞5×106個經(jīng)尾靜脈回輸至受鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)共分為5組:①尾靜脈外周造血干細(xì)胞輸注(IV-PBSCT)組(A,n=8):經(jīng)尾靜脈干細(xì)胞移植;②髓腔內(nèi)外周造血干細(xì)胞輸注(IBM-PBSCT)組預(yù)處理對照組(B,n=8):經(jīng)骨髓腔內(nèi)干細(xì)胞移植;③尾靜脈外周造血干細(xì)胞輸注-供者淋巴細(xì)胞輸注(IV-PBSCT-DLI)組(C,n=8):尾靜脈干細(xì)胞移植后輸注供鼠淋巴細(xì)胞;④髓腔內(nèi)外周造血干細(xì)胞輸注-供者淋巴細(xì)胞輸注(IBM-PBSCT-DLI)組(D,n=8):骨髓腔內(nèi)干細(xì)胞移植后輸注供鼠淋巴細(xì)胞;⑤對照組(E,n=8):僅給予 TBI+CTX。所有實(shí)驗(yàn)分組均未予GVHD預(yù)防性治療。

1.4 嵌合體檢測

第7天取靜脈血 500 μ L,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,提取基因組DNA(DNA全血樣本抽提試劑盒,荷蘭QIAGEN公司產(chǎn)品),終濃度為0.5 μ g/L,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SRY 引物(南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成)序列:5′-TGGTGTGGTCCCGTGGTGAGAG-3′(上游),5′-GATGGCATGTGGGT TCCTGTCC-3′(下游),目的基因296 bp。體系:5×PCR緩沖液 20 μ L,50 mmol/L mgCl2 2.5 μ L,dNTPs 2 μ L,100 μ mol/L上游及下游引物各0.1 μ L,DNA模板4 μ L,TaqDNA 聚合酶 1.0 U,補(bǔ)足體系至100 μ L。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性60 s,60℃退火60 s,72℃延伸60 s,共循環(huán)40次,72℃再延伸10 min。3%瓊脂糖凝膠電泳后,利用Image Master VDS凝膠掃描儀成像并進(jìn)行圖像的半定量分析,所有B6小鼠擴(kuò)增產(chǎn)物的嵌合率以(B6/BA)%來表示。

1.5 一般情況觀察

每日記錄小鼠的毛發(fā)、體位、體型、有無腹瀉等,體重每3天稱量記錄,記錄小鼠存活情況;將死亡后小鼠的脾臟、肝臟及小腸取材后固定保存(10%甲醛),集中進(jìn)行常規(guī)病理檢測判斷GVHD。將小鼠出現(xiàn)精神不振、食納下降、翹毛、弓背及體重驟降等表現(xiàn)定義為GVHD癥狀。

1.6 流式檢測CD4+CD25+及CD4+/CD8+細(xì)胞比例

各實(shí)驗(yàn)組及正常B6小鼠在d28處死后取脾臟,制備脾細(xì)胞懸液后取100 μ L。設(shè)立試驗(yàn)管及對照管,試驗(yàn)管中均加入單克隆熒光抗體小鼠FITC-CD4、PE-CY5-CD8,PE-CD25單抗(美國eBioscience公司產(chǎn)品)20 μ L,陰性對照管中加入相應(yīng)的同型對照陰性抗體FITC-IgG2b、PECY5-IgG2a、PE-IgG1(美國 eBioscience公司產(chǎn)品)。每份脾細(xì)胞懸液分別加入試驗(yàn)管及對照管各50 μ L,室溫靜置孵育 10 min,加入溶血劑,室溫放置5～10 min后,再加入2 mL蒸餾水放置10 min至透明,1 500 r/min離心5 min,棄去上清后加入500 μ LPBS后上機(jī)檢測。以陰性對照管射門參數(shù)檢測CD4+、CD8+及CD4+CD25+細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 嵌合狀態(tài)

第7天除預(yù)處理對照E組雌性B6小鼠外,其余各組均在DNA水平上檢測到雄性供鼠的SRY基因。經(jīng)半定量分析,各組平均嵌合率為:A組(32.76±3.69)%,B組(58.29±5.37)%,C組(53.16±6.39)%,D組(87.51±9.82)%。各組小鼠均形成了混合嵌合體,B組嵌合率明顯高于A組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),DLI后嵌合率均有所上升,D組嵌合率的增高水平明顯高于C組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 小鼠生存狀態(tài)

各移植組部分小鼠d+5開始出現(xiàn)不同程度的GVHD表現(xiàn),以C組小鼠GVHD癥狀較為嚴(yán)重并于第9天開始出現(xiàn)死亡,A組次之,B、D 2組均未見明顯的GVHD表現(xiàn)。其中A組死亡1只,C組死亡3只,B、D組死亡1只。E組小鼠d3起出現(xiàn)精神不振,食納減少,體重略有下降,第7天開始恢復(fù),后期2只死于感染,1只死于意外。

2.3 病理檢查結(jié)果

①脾臟萎縮,正常結(jié)構(gòu)破壞,大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤;②肝細(xì)胞不同程度變性壞死,中央靜脈及肝血竇擴(kuò)張、淤血,廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤;③小腸黏膜水腫充血,絨毛壞死脫落,黏膜下層淋巴細(xì)胞浸潤。各組死亡小鼠的病理檢查符合GVHD表現(xiàn),其改變基本相同。

2.4 T淋巴細(xì)胞亞群

C組CD4+CD25+占脾淋巴細(xì)胞比例明顯降低,B、D 2組CD4+CD25+占脾淋巴細(xì)胞比例則明顯升高,各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。移植后各組小鼠的CD4+/CD8+比值均較預(yù)處理對照組升高,接近正常對照組。見表1。

表1 小鼠流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+占脾淋巴細(xì)胞比例( ±s)

表1 小鼠流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+/CD8+比值及CD4+CD25+占脾淋巴細(xì)胞比例( ±s)

與正常對照組比較,＊P<0.05

T淋巴細(xì)胞 正常對照 A組 B組 C組 D組 E組CD4+/CD8+ 1.792±0.078 1.506±0.042＊ 1.753±0.065 1.319±0.092＊ 1.704±0.087 1.453±0.068＊CD4+CD25+比例 15.62% 12.28% 28.73%＊ 8.06%＊ 25.64%＊ 14.75%

3 討 論

造血干細(xì)胞是存在于造血組織中的一群原始造血細(xì)胞,具有自我更新及分化成熟為各種血細(xì)胞和免疫活性細(xì)胞的能力,不僅重建了患者的造血功能,亦重建了患者的免疫功能。近期大量研究表明通過髓腔內(nèi)注射的方式有效的促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的歸巢、迅速重建骨髓造血以機(jī)體免疫功能,在誘導(dǎo)免疫耐受的同時降低了GVHD的發(fā)病率[2-4]。本實(shí)驗(yàn)選取H-2差異的近交系小鼠,在TBI聯(lián)合CTX的非清髓性預(yù)處理方案后分別經(jīng)尾靜脈及骨髓腔兩種途徑進(jìn)行外周造血干細(xì)胞移植,并在此基礎(chǔ)上給予DLI。嵌合體檢測結(jié)果顯示髓腔內(nèi)輸注外周造血干細(xì)胞組C57BL/6(H-2b)受鼠第7天的嵌合率達(dá)58%,顯著優(yōu)于經(jīng)尾靜脈輸注組,在其基礎(chǔ)上的IBM-PBSCTDLI組嵌合率高達(dá)87.5%同時降低了GVHD的發(fā)病率。髓腔內(nèi)注射避免了造血干細(xì)胞在受者血循環(huán)中的損耗,簡化了干細(xì)胞的歸巢過程,同時相對大量的干細(xì)胞增加了歸巢的競爭能力。經(jīng)GCSF動員后不但明顯增加了CD34+干細(xì)胞的數(shù)量,也使CD3+細(xì)胞數(shù)量增加近3倍,并對細(xì)胞因子的表達(dá)有著重要影響,包括增加白介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β和IFN-α的水平[5]。這些因素共同促進(jìn)了供者細(xì)胞的嵌合,顯著促進(jìn)了骨髓造血修復(fù)。通過髓腔內(nèi)注射外周造血干細(xì)胞成功構(gòu)建了小鼠移植模型,并未進(jìn)一步研究DLI在移植后的作用創(chuàng)造了條件。

流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群是評價移植術(shù)后免疫狀態(tài)的常用方法。經(jīng)亞致死劑量照射后小鼠的淋巴細(xì)胞一般在30 d后開始恢復(fù),逐漸達(dá)正常水平。CD4+CD25+Treg作為抑制性T細(xì)胞的一種功能亞群,在機(jī)體的抗腫瘤免疫的重要組成部分,近年來的許多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在移植免疫中同樣發(fā)揮了重要作用。無論是人類白細(xì)胞抗原(HLA)全相合或半相合外周造血干細(xì)胞移植還是移植后的DLI,高水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均明顯移植了急性GVHD的發(fā)生,同時促進(jìn)了移植早期的免疫重建[6-7]。Kim等[8]報道在慢性GVHD狀態(tài)下去除CD4+CD25+Treg,不但誘導(dǎo)了急性GVHD的出現(xiàn),同時促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)中第28天進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,CD4+CD25+Treg在IV-PBSCT-DLI組中比例明顯降低,而IBM-PBCST及IBM-PBSCT-DLI組均顯著升高,推測CD4+CD25+T reg可能與IBM-PBSCT/DLI降低了GVHD發(fā)病率相關(guān),而其對于CD8+T細(xì)胞可能存在一種優(yōu)先抑制作用,進(jìn)而導(dǎo)致了相應(yīng)的CD4+/CD8+比值的改變。但CD4+CD25+Treg本身的免疫抑制功能是否會影響GVL效應(yīng)仍需進(jìn)一步探討。

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