堿性脂肪酶在有機相中催化合成戊酸乙酯*

福建師范大學生命科學學院 陳建平 王根宇 鄧 穎 李建偉

戊酸乙酯是一類短鏈脂肪酸酯，無色油狀液體，呈天然水果香味，是重要的香精、香料組分。戊酸乙酯與丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等酯類物質同被稱為芳香酯，廣泛地應用于食品、醫(yī)療、化妝品及醫(yī)藥等日常生活用品中[1]。

通常情況下, 芳香和香味成分是由化學合成或從天然來源中提取的?；瘜W合成法通常需在高溫高壓及強酸條件下進行, 副反應多、產物分離難、生產成本高, 且隨著脂肪酸和脂肪醇碳鏈的加長，反應難度加大；而從植物中提取芳香物質的量有限，無法滿足人們的需求。目前國內外多有研究采用以脂肪酶為催化劑的方法來催化合成芳香類物質，而其中以微生物脂肪酶為催化劑較為常見[2,3]。和化學合成法相比，酶法生物合成的芳香酯不僅被認為是高質量的天然產品，而且具有反應條件溫和、轉化率高、專一性好、易提取、易控制等優(yōu)點，被看成是很有希望工業(yè)化的新途徑[3,4]。酯化反應以微生物脂肪酶作為催化劑，具有顯著特點：反應條件比較溫和，醇用量較少, 幾乎沒有污染物排放, 產物易分離純化，對設備性能要求較低。因此，利用酶法酯化合成生產芳香酯類物質是一種較好的選擇。本研究以國產堿性脂肪酶為催化劑，在不同的有機相中催化戊酸酯化合成戊酸乙酯，考察了各種因素對戊酸轉化率的影響，探討并得出了適宜的酶催化反應條件。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶

擴展青霉（Penicillium expansum）堿性脂肪酶：由福建師范大學生命科學學院提供。

1.2 化學試劑

橄欖油、戊酸為化學純。 其它試劑均為分析純。正辛烷、正庚烷、石油醚等有機溶劑在使用前用 3A分子篩作脫水處理。

1.3 儀器

恒溫搖床, 高速組織搗碎機，磁力攪拌器，電熱恒溫水浴鍋, 堿式滴定管，常規(guī)玻璃器皿等。

1.4 堿性脂肪酶催化合成戊酸乙酯的反應體系的構成

在100mL具塞三角瓶中，將0.020mol/L的戊酸、與戊酸成一定摩爾比的乙醇和15mL的有機溶劑組成非水相酯化反應體系，加入一定量的堿性脂肪酶作為合成反應的催化劑。在控制適當溫度的恒溫搖床中以150 r/min的速度旋轉振蕩。間隔一定時間加入一定量的3A分子篩以移走產物中的部分水分。定時取樣分析檢測酶催化酯化合成反應體系中戊酸的轉化率。

1.5 堿性脂肪酶的酶活測定

采用NaOH中和滴定法測定堿性脂肪酶的酶活[5]。

1.6 戊酸轉化率的測定

反應一定時間后，取0.5mL樣品，加入95%乙醇10 mL，以1%酚酞為指示劑，用0.025 mol/L NaOH標準溶液滴定，并按下式計算戊酸的轉化率：

式中：α——戊酸的轉化率；

V0——反應初始時樣品耗堿體積，mL；

V——反應一定時間后樣品耗堿體積，mL。

2 結果與討論

2.1 戊酸與乙醇的摩爾比對酯化反應轉化率的影響

按1.4的方法構建反應體系：戊酸濃度為0.02mol/L，加入正辛烷15mL，堿性脂肪酶0.45g（相當于840 U / g戊酸），戊酸與乙醇的摩爾比分別為1.0:1.1，1.0:1.2，1.0:1.3，1.0:1.4，1.0:1.5，1.0:1.6，在恒溫搖床中，控制反應溫度為 36℃，反應時間為24h。實驗結果如圖1所示。

從圖中看出：當戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5時，戊酸的轉化率為最高。這是因為堿性脂肪酶在催化戊酸和乙醇合成戊酸乙酯的酯化反應中，根據(jù)化學平衡原理，適當增加反應物乙醇的濃度可以使反應平衡向正反應方向移動，從而提高戊酸的轉化率。但是，由于乙醇本身也是一種酶的失活劑，當乙醇的濃度過大時會降低酶的活性，使戊酸的轉化率下降。

圖1 底物摩爾比對戊酸轉化率的影響

2.2 加入堿性脂肪酶的酶量對酯化反應的影響

按1.4的方法構建反應體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入正辛烷15mL，在恒溫搖床中，控制反應溫度為36℃，反應時間為24h，探討不同加酶量對酯化反應中戊酸轉化率的影響。結果如圖2所示?？梢钥闯觯诩用噶繛?.45g（相當于840 U / g戊酸）時，戊酸的轉化率為最高，可達98%。

圖2 酶用量對戊酸轉化率的影響

2.3 不同有機溶劑對酯化反應的影響

按1.4的方法構建反應體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，堿性脂肪酶0.45g（相當于840 U / g戊酸），各種有機溶劑的加入量分別為15mL。在恒溫搖床中，控制反應溫度為36℃，反應時間為24h，探討不同有機溶劑對酯化反應轉化率的影響。結果如圖3所示。以正辛烷為有機溶劑時，戊酸的轉化率為最高。

圖3 有機溶劑對戊酸轉化率的影響

2.4 反應溫度對酯化反應的影響

按1.4的方法構建反應體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入堿性脂肪酶0.45g（相當于840 U / g戊酸），加入15mL正辛烷。反應時間為24h，探討不同反應溫度對酯化反應戊酸轉化率的影響。結果如圖4所示，酯化反應的最適宜溫度為36℃，此時戊酸轉化率可達98%。此最適宜反應溫度與擴展青霉堿性脂肪酶的酶學特性相一致[6]。

圖4 反應溫度對戊酸轉化率的影響

2.5 反應時間對酯化反應的影響

按1.4的方法構建反應體系：戊酸濃度為0.02mol/L，戊酸與無水乙醇的摩爾比為1.0:1.5，堿性脂肪酶0.45g（相當于840U/ g戊酸），有機溶劑為15mL的正辛烷，反應溫度為36℃，探討不同反應時間對酯化反應的戊酸轉化率的影響。結果如圖5所示。從圖中看出：在24h內，戊酸轉化率上升較快；在24h過后仍能保持較高轉化率。但從實際生產的經濟性等綜合考慮，反應時間取24h較為適宜。

圖5 反應時間對戊酸轉化率的影響

3 結論

采用國產堿性脂肪酶在有機相中催化合成戊酸乙酯，通過實驗室研究以優(yōu)化酶法酯化合成條件。當戊酸濃度為0.020mol/L時，戊酸與乙醇的摩爾比為1.0:1.5，加入脂肪酶酶量為0.45g（相當于840U / g戊酸），在有機溶劑為正辛烷，恒溫搖床中以150 r/min的速度旋轉振蕩，反應溫度為36℃，反應時間為24h，并適時加入一定量的3A分子篩移走產物中的部分水分。在上述最佳反應條件下進行戊酸乙酯的酯化合成反應，戊酸的轉化率可達 98% 。由此可見國產擴展青霉堿性脂肪酶是一種優(yōu)異的酯化合成生物催化劑。

[1]許開天，許葵，甘毅. 酒精制品的生產與配方[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1995.

[2]馬歌麗, 彭新榜, 陳海明. 微生物脂肪酶及其催化合成芳香酯研究進展[J].鄭州輕工業(yè)學院學報(自然科學版) ，2002, 17(3) : 50-53.

[3]陳建平，葛清秀，黃祖新. 堿性脂肪酶在正庚烷中催化合成己酸乙酯的研究[J]. 福建師范大學學報(自然科學版), 2005,21(4) ：117-120.

[4]徐巖, 郭翔, 章克昌. 有機介質中酶法生物轉化酒用芳香酯的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1998，25（1）：20-24.

[5]陳建平. 堿性脂肪酶酶活測定的影響因素探討[J]. 福建師范大學學報(自然科學版), 2001, 17 (增刊) : 24 -27 , 45.

[6]鄭毅，龔福生，施巧琴等. 擴展青霉脂肪酶催化性質的研究[J]. 藥物生物技術，2000,7（2）：98-101.