動(dòng)脈粥樣硬化斑塊OxLDL靶向的MR分子影像學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

付明翠，文 頌，盧 瞳，柳東芳，周官輝，安艷麗，廖 蕾，居勝紅，滕皋軍

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)及其相關(guān)心腦血管疾病是西方發(fā)達(dá)國家患者死亡和致殘的首位原因[1]。在我國，近年來AS的發(fā)病率也有明顯增加的趨勢(shì)。最新的研究表明，急性心腦血管事件(腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作、急性冠脈綜合征) 主要是由于動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)的易損性斑塊引起的[2]，而與血管狹窄程度無直接關(guān)系[3]。傳統(tǒng)影像技術(shù)在診斷動(dòng)脈粥樣硬化斑塊時(shí)，只能顯示斑塊所造成的血管狹窄程度，并不能有效地反映斑塊的病理生理學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性。近年來，分子影像技術(shù)作為易損斑塊早期檢測(cè)的一種新策略，引起心血管病研究者的重視[4,5]。

氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展以及不穩(wěn)定斑塊進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用[6,7]。本研究以oxLDL作為MR分子影像成像靶點(diǎn)，構(gòu)建anti-oxLDL-USPIO靶向分子探針，采用7.0 T micro-MR 成像檢測(cè)apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣斑塊中oxLDL的動(dòng)態(tài)變化，建立動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的特異性評(píng)價(jià)體系，并為下一步探討他汀類藥物治療AS 的作用機(jī)制和療效評(píng)價(jià)提供一個(gè)新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

超微超順磁氧化鐵粒子(聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG)包被USPIO，表面攜帶羧基活性基團(tuán)，由中國科學(xué)院化學(xué)所惠贈(zèng)[8,9])，兔抗小鼠anti-oxLDL多克隆抗體(北京博奧森公司)，非特異性小鼠IgG抗體(北京博奧森公司)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和Sulfo-NHS均為上海共價(jià)化學(xué)公司產(chǎn)品，硼酸(江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司)，十水合四硼酸鈉(西隴化工股份有限公司)，微量震蕩器(上海亞榮生化儀器廠)，高速冰凍離心機(jī)(eppendorf centrifuge 5804R)，透射電子顯微鏡(TEM,JEM-200CX, 日本JEOL 公司)，動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)(90 Plus ParticleSize Analyzer, Brookha-ven公司)，超濾離心管(100KD, Millipore公司產(chǎn)品)，7.0 T micro-MR成像儀(德國Bruker公司)，冰凍切片機(jī)(CMI950，Leica)，SP免疫組化試劑盒 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色劑(福建邁新公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 探針構(gòu)建及特征檢測(cè)

取1mg PEG包被的USPIO溶于PH9的硼酸/硼酸鈉緩沖溶液(500 μl)中，然后加入EDC 1 mg及sulfa-NHS 0.5 mg混勻，室溫下震蕩20 min后，加入antioxLDL抗體 200 μg，室溫下輕輕搖動(dòng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，使用超濾離心管離心除去未結(jié)合的游離抗體。純化好的anti-oxLDL-USPIO靶向探針重新懸浮于PBS中，4 ℃保存，濃度為1 mg Fe/ml。非特異性IgG-USPIO制備方法同上。采用透射電鏡檢測(cè)磁性納米顆粒的形貌，動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)磁性納米顆粒的水合粒徑及探針穩(wěn)定性，采用酶聯(lián)免疫吸附間接法(ELISA)檢測(cè)免疫磁性納米顆粒的活性，納米探針的T2及T1弛豫時(shí)間采用7.0 T micro-MRI進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 ApoE-/-小鼠套管法頸動(dòng)脈粥樣硬化模型建立

SPF級(jí)apoE-/-小鼠(18只，8～10周齡，20.4±0.76 g)購自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。ApoE-/-小鼠予高脂飲食(脂肪10%，膽固醇2%，南京協(xié)同醫(yī)藥生物工程公司)喂養(yǎng)2周后, 腹腔注射10% 水合氯醛溶液(0.35 ml/100 g)麻醉后手術(shù)切開暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈, 在頸動(dòng)脈距離頸動(dòng)脈分叉約0.5 mm處放置套管(內(nèi)徑0.38 mm，外徑0.5 mm，長約2 mm)，并用2層絲線固定[10]。所有操作均在10倍體視顯微鏡下進(jìn)行。術(shù)后待小鼠蘇醒后將其放回籠中，維持環(huán)境溫度在20～25 ℃，燈光保持開閉各12 h。所有小鼠繼續(xù)高脂飲食3周，然后行MR成像。本實(shí)驗(yàn)得到東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為anti-oxLDL-USPIO組(6只)，非特異性IgG-USPIO組(4只)，單純USPIO組(4只)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制組，(1 mg anti-oxLDL-USPIO與1 mg antioxLDL-Abs混合后使用，4只)，分別經(jīng)尾靜脈注入anti-oxLDL-USPIO、非特異性IgG-USPIO，單純USPIO以及anti-oxLDL-USPIO/anti-oxLDL-Abs混合物, 劑量為30 mg Fe/kg，并于注藥前、注藥后8 h及24 h進(jìn)行MRI成像。

1.2.4 MR成像

采用德國Bruker 7.0 T micro-MR成像系統(tǒng)，水平掃描架內(nèi)徑16 cm，使用38 mm大鼠頭線圈。使用4 %異氟烷麻醉后把小鼠置于有機(jī)玻璃掃描床內(nèi)，利用牙套及耳桿固定鼠腦。以1.5%異氟烷:空氣混合氣體維持麻醉狀態(tài),并監(jiān)護(hù)心率、呼吸。為了使不同時(shí)間點(diǎn)的MR圖像可以進(jìn)行匹配，MR成像以小鼠主動(dòng)脈弓上緣作為起點(diǎn)向上進(jìn)行連續(xù)掃描。掃描采用軸位T2-PD雙回波MSME(multi slices multi echo)自旋回波序列，掃描參數(shù)：TR 3058 ms，TE 65 ms/13 ms; 層厚0.5 mm，層間距 0，層數(shù) 25層，F(xiàn)OV 2.5 cm×2.5 cm，采集次數(shù) 3， 矩陣 256×256，空間最小分辨率98 μm×98 μm，掃描時(shí)間約為30 min。

1.2.5 MR數(shù)據(jù)分析

所有MR圖像放大300%后，由兩位獨(dú)立的放射科醫(yī)生目測(cè)匹配層面小鼠頸動(dòng)脈血管信號(hào)改變并確定不同時(shí)間點(diǎn)(注入藥物前、注入藥物后8 h和24 h)匹配的MR圖像組。通過比較匹配的MR圖像上注入探針前、后頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊信號(hào)的改變，畫出感興趣區(qū)(ROI)。采用Bruker 7.0 T自帶的paravision 5.0軟件測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)相同層面血管斑塊信號(hào)改變區(qū)的MR信號(hào)強(qiáng)度(SIplaque)，并與相鄰肌肉的MR信號(hào)強(qiáng)度(SImuscle)進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度(relative signal intensity, rSI)[3,11]。采用相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度改變率(relative signal intensity changes, rSIC)評(píng)估注藥后不同時(shí)間點(diǎn)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊ROI區(qū)相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的改變率。

表1 不同USPIO探針的物理特征Table 1 The physical properties of various USPIO nanoparticles

計(jì)算公式為：

rSIn表示為注藥后不同時(shí)間點(diǎn)的ROI相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，rSIpre為注藥前ROI的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.6 頸動(dòng)脈標(biāo)本的處理與測(cè)定

MR掃描結(jié)束后，小鼠腹腔過量麻醉。非直視下心臟取血后，開胸，充分暴露心臟，左心室灌注PBS 50～100 ml后，中性福爾馬林原位固定10～15 min。體視顯微鏡下取出左側(cè)頸動(dòng)脈，取材長度為左側(cè)頸動(dòng)脈分叉水平到套管下方5 mm處，小心剝離頸動(dòng)脈外套管后，OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度約6 μm。以頸動(dòng)脈分叉為起點(diǎn)，每個(gè)頸動(dòng)脈切10～12層，每層間隔500 μm，與MR圖像進(jìn)行匹配，常規(guī)HE染色。

1.2.7 免疫組化分析

使用CD68(1:100, Biolegend)檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞分布，使用anti-oxLDL-Abs (1∶100, Bioss)檢測(cè)斑塊內(nèi)oxLDL分布，染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.8 普魯士藍(lán)染色

將冰凍切片用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定20 min，普魯士藍(lán)反應(yīng)液(等體積10%鹽酸水溶液與10%亞鐵氰化鉀臨時(shí)混合)孵育10 min，蒸餾水洗滌3次，0.5%核固紅復(fù)染3 min，再蒸餾水洗滌3次，置正置相差顯微鏡下觀察鐵染色情況。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

圖1 anti-oxLDL-USPIO透射電鏡圖像Fig 1 TEM photograph of anti-oxLDL-USPIO nanoparticle.

2 結(jié)果

2.1 探針特征

磁性納米探針的物理特性見表1。合成好的antioxLDL-USPIO呈淡黃色，澄清，無明顯沉淀，透射掃描電鏡顯示anti-oxLDL-USPIO靶向磁性納米顆粒呈細(xì)顆粒狀外觀，大小均一，粒徑大小為11.8±1.5 nm，散在分布(圖1)；ELISA結(jié)果顯示，anti-oxLDLUSPIO OD450值與單純anti-oxLDL抗體接近； antioxLDL-USPIO煮沸后及單純USPIO的OD450值明顯降低，與單純anti-oxLDL-USPIO比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05(圖2)。

2.2 MR成像

尾靜脈分別注入anti-oxLDL-USPIO、IgGUSPIO、單純USPIO及anti-oxLDL-USPIO/antioxLDL-Abs混合物前、注入后8 h、24 h行MR成像，所有動(dòng)物生存質(zhì)量良好，未見明顯毒性作用。共獲得66組(198副)不同時(shí)間點(diǎn)匹配的MR圖像進(jìn)入信號(hào)強(qiáng)度分析，每只動(dòng)物提供3～6個(gè)可用的MR圖像組。注入探針前，各組動(dòng)物頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在MR T2WI圖像上顯示為管壁信號(hào)不均勻增高，管壁增厚，管腔狹窄，平均相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度分別為

圖2 ELISA結(jié)果顯示靶向探針的生物學(xué)活性Fig 2 ELISA results showed the activity of pure antibody, anti-oxLDL-USPIOs, unconjugated USPIOs and boiled anti-oxLDL-USPIOs on OD450 values.

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)ApoE-/-鼠頸動(dòng)粥樣硬化斑塊T2WI圖像。3A～3C分別為注入anti-oxLDL-USPIO前、注入后8 h、24 h MR T2WI圖像。3D為病理圖片(普魯士藍(lán)染色)顯示斑塊內(nèi)見鐵沉積Fig 3 T2-weighted images at pre-, 8 h and 24 h post injection of anti-oxLDL-USPIO (A-C).The Prussian blue stain (D) showed the USPIO was deposited in the plaque.

2 2.14±0.55 (n=24)、2.63±0.69 (n=16)、2.49±0.69(n=16) 和1.97±0.87 (n=10)， 各組間比較無顯著性差異，P＞0.05。注入anti-oxLDL-USPIO后8 h及24 h后，與注藥前比較，信號(hào)改變率達(dá)-30.4±16%、-34.7±19%，與注藥前比較P值均小于0.01，普魯士藍(lán)染色顯示頸動(dòng)脈斑塊信號(hào)減低區(qū)有大量鐵顆粒沉積(圖3)；非特異性IgG-USPIO組8 h及24 h頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相對(duì)信號(hào)改變率分別為4.2±17.4%和-4.8±15.8%，與注藥前比較，P值分別為0.495和0.121；單純USPIO組8 h及24 h頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相對(duì)信號(hào)改變率分別為-0.01±27.6%、1.39±19.0%，與注藥前比較，P值分別為0.775和0.812；競(jìng)爭(zhēng)性抑制組8 h及24 h頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相對(duì)信號(hào)改變率分別為-6.9±17.5% 和-8.2±16.1%，與注藥前比較，P值分別為0.595和0.12。普魯士藍(lán)染色顯示頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)僅見少量的點(diǎn)狀鐵顆粒沉積，各時(shí)間點(diǎn)與anti-oxLDL-USPIO組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05(圖4)。

2.3 病理及免疫組化分析

圖5 頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病理及免疫組化染色。5A～5C分別為普魯士藍(lán)染色，oxLDL及CD68免疫組化染色，黃色箭頭顯示經(jīng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的鐵沉積。L顯示為頸動(dòng)脈內(nèi)腔Fig 5 History and immunohistochemistry of carotid atherosclerosis lesions.Prussian blue stain(A) and Immunohistochemistry stain of oxLDL (B) and CD68 (C), yellow arrows show the iron deposition.L indicates the lumen of carotid.

Anti-oxLDL-USPIO探針組小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊相同層面分別行普魯士藍(lán)染色、oxLDL 及CD68免疫組化染色，結(jié)果顯示，普魯士藍(lán)染色片上藍(lán)染顆粒與oxLDL、CD68棕色顆粒分布基本一致(圖5)。

3 討論

本研究以聚乙二醇(PEG)包被的USPIO納米顆粒作為成像載體，通過EDC/sulfa-NHS方法，構(gòu)建antioxLDL-USPIO靶向探針，其水合粒徑約為30 nm，在PBS溶液中具有良好的穩(wěn)定性及生物學(xué)活性。與巨噬細(xì)胞被動(dòng)靶向的葡聚糖包被的USPIO比較[12,13]，本實(shí)驗(yàn)中所用的PEG包被的USPIO具有能夠降低血漿蛋白結(jié)合率，減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除率，增加循環(huán)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)，因而更適用于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分子影像學(xué)研究[14]。小鼠活體MRI顯示，注入anti-oxLDLUSPIO探針后8 h，apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部信號(hào)即可看到減低，24 h后信號(hào)減低更為明顯，普魯士藍(lán)染色證實(shí)信號(hào)減低區(qū)內(nèi)有大量USPIO顆粒沉積，與oxLDL及CD68免疫組化陽性區(qū)域一致；在競(jìng)爭(zhēng)性抑制組，小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊信號(hào)在8 h及24 h僅輕度降低，與靶向探針組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，其原因與游離的anti-oxLDL抗體可能與靶向探針競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特定作用位點(diǎn)有關(guān)；注入非特異性IgG-USPIO及單純USPIO后，小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊信號(hào)輕度減低；病理及免疫組化結(jié)果顯示anti-oxLDL-USPIO主要在oxLDL含量豐富的巨噬細(xì)胞內(nèi)沉積。小鼠體內(nèi)研究結(jié)果及免疫組化證實(shí)，anti-oxLDL-USPIO可以作為oxLDL 特異性靶向分子影像成像載體，可以無創(chuàng)、活體檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)oxLDL及巨噬細(xì)胞的分布。

OxLDL在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用，是導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊發(fā)生的重要因素[15,16]。OxLDL可以導(dǎo)致斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增生與移行，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，啟動(dòng)瀑布效應(yīng)，促進(jìn)血栓形成。在分子水平，oxLDL可以促進(jìn)多種粘附分子、熱休克蛋白的表達(dá)上調(diào)，抑制NO和前列腺環(huán)素的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)多種促炎癥細(xì)胞因子和生長因子的表達(dá)。OxLDL是一種復(fù)雜抗原，其組成成分如載脂蛋白(apoB100)、磷脂、脂肪酸等均可以發(fā)生氧化反應(yīng)，這些氧化位點(diǎn)可以產(chǎn)生多種單克隆抗體，如MDA2[17]、IK17[18]、E06等。Torzewski等[19]使用I125-MDA2抗體檢測(cè)兔主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL的分布，研究進(jìn)一步顯示，使用他汀類藥物干預(yù)后，斑塊內(nèi)的I125-MDA2核素濃聚明顯減低；Briley-Saebo等[20]使用E06、MDA2和IK17抗體接載釓劑微球構(gòu)建oxLDL氧化特異性表位的MR分子探針，研究結(jié)果表明，主動(dòng)脈粥樣硬化apoE-/-小鼠尾靜脈注入MDA2-釓劑微球、E06釓劑微球、IK17釓劑微球后24～72 h后，主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊信號(hào)明顯增加，72h最為明顯，其強(qiáng)化率達(dá)到125%、137%和231%；使用游離的MDA2抗體與MDA2-釓劑微球競(jìng)爭(zhēng)oxLDL氧化特異性表位后，其血管信號(hào)強(qiáng)化明顯減低；非特異性IgG-釓劑微球未見明顯信號(hào)改變。隨后，Briley-Saebo等[21]又使用E06、MDA2和IK17抗體接在脂質(zhì)體包裹的USPIO上，構(gòu)建抗體-USPIO靶向探針，研究發(fā)現(xiàn)，apoE-/-小鼠經(jīng)過眼眶靜脈注入抗體-USPIO靶向探針后24 h，主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊T2值減少，以E06-USPIO組T2值減少最為明顯，與釓劑微球?qū)嶒?yàn)結(jié)果相仿。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，盡管都是用oxLDL靶向單克隆抗體，但是MDA2、IK17靶向探針與E06靶向探針在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的顯示效果存在一定差別，提示oxLDL單克隆抗體不能充分反映斑塊內(nèi)的oxLDL分布的狀況。本實(shí)驗(yàn)以oxLDL多克隆抗體作為斑塊內(nèi)的oxLDL識(shí)別抗體，在8 h即可以看到斑塊信號(hào)的降低，使用過量的游離anti-oxLDL抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制后，斑塊信號(hào)降低程度明顯減弱。針對(duì)oxLDL這樣一種復(fù)雜抗原，本研究為oxLDL靶向分子影像提供了新的研究策略。

本研究也存在一些問題。首先，各組的動(dòng)物數(shù)量相對(duì)較少，大樣本的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究更具有說服力。其次，本實(shí)驗(yàn)中使用的USPIO的劑量相對(duì)過高。對(duì)探針進(jìn)行改良，使其保持探針特異性的同時(shí)并能改善其藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征是本實(shí)驗(yàn)下一步研究的方向。最后，本實(shí)驗(yàn)所用的納米材料的生物安全性還有待進(jìn)一步評(píng)估。

總之，本研究合成了oxLDL靶向的USPIO納米探針，可在活體MR上檢測(cè)測(cè)apoE-/-小鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL分布，其分布區(qū)與斑塊內(nèi)oxLDL表達(dá)區(qū)及巨噬細(xì)胞浸潤區(qū)呈正相關(guān)。AntioxLDL-USPIO可以在24 h內(nèi)特異性顯示頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的oxLDL分布，有助于不穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的早期檢測(cè)及藥物療效評(píng)估。

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