活體MR成像監(jiān)測移植干細(xì)胞治療SD大鼠心肌梗死并評價左心功能的可行性研究

曹 劍，王怡寧*，孔令燕，薛華丹，馬國濤，雷 晶，何泳藍(lán)，李 琢，金征宇，孟 潔

近年來，細(xì)胞療法(cell-based therapy)已經(jīng)成為治療缺血性心肌病的一種選擇[1-2]。動物模型及臨床心梗患者的研究結(jié)果表明，干細(xì)胞移植治療對心梗后左室重構(gòu)及心室功能的改善都有積極意義[3-5]。干細(xì)胞移植途徑選擇最多的為經(jīng)冠脈注射和心肌內(nèi)直接注射。雖然前者在介入操作下可以對目標(biāo)血管進(jìn)行灌注給藥，但是當(dāng)冠脈閉塞時，后者更具有優(yōu)勢，可以對靶心肌進(jìn)行注射給藥以達(dá)到治療目的[6]。既往涉及小動物模型的研究中，多采用有創(chuàng)性手段檢測心功能，提取病理組織標(biāo)本對移植細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測[7-8]，這些手段對于今后臨床應(yīng)用不是最佳選擇。在臨床心臟成像方面，磁共振檢查已經(jīng)成為常規(guī)項目，其中1.5 T MR成像儀是目前應(yīng)用最廣泛的。本研究通過建立心梗模型并選擇心肌內(nèi)直接注射方式移植超小超順磁性氧化鐵(USPIO)標(biāo)記的干細(xì)胞，探索利用臨床型1.5TMR成像儀對移植干細(xì)胞進(jìn)行活體監(jiān)測、同時對小動物心功能進(jìn)行無創(chuàng)性評估的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠15只，隨機(jī)分為空白對照組(n=5)和實驗組(n=10)，性別不限，體重320～370 g，購自北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗中心。本研究獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會同意。

1.1.2 實驗試劑

SD大鼠脂肪來源干細(xì)胞(adipose derived stem cells, ADSCs)及完全培養(yǎng)基(賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司)，USPIO (Bayer Schering Pharma AG公司, 德國)，0.01%多聚賴氨酸(PLL)(Sigma, 美國)，MTS(Promega, 美國)。

1.1.3 實驗設(shè)備

1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀(Signal Excite HD，GE，美國)，ALC-V8D小動物呼吸機(jī)(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 USPIO體外標(biāo)記SD大鼠ADSCs

配制濃度為USPIO 40 μg Fe/ml、PLL 1.5 μg/ml的含鐵培養(yǎng)基，其中PLL作為轉(zhuǎn)染劑，將狀態(tài)良好的ADSCs在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)孵育過夜(24 h)。選擇普魯士藍(lán)染色和透射電鏡檢查對標(biāo)記有效性進(jìn)行檢測：普魯士藍(lán)染色可將USPIO顆粒染成藍(lán)色，光學(xué)顯微鏡下觀察并計算標(biāo)記陽性率；透射電鏡可直接觀察到USPIO顆粒是否位于ADSCs內(nèi)部。

1.2.2 標(biāo)記安全性檢測

選擇MTS(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium, inner salt)比色分析法對不同濃度的USPIO(濃度梯度：0、10、20、40、80、160 μg Fe/ml)標(biāo)記細(xì)胞的安全性進(jìn)行檢測，利用酶標(biāo)儀比色檢測，評價標(biāo)記安全性。

1.2.3 建立SD大鼠心梗模型及心肌注射標(biāo)記ADSCs

空白對照組(n=5)不做任何處理，實驗組(n=10)于腹腔麻醉成功后行氣管穿刺插管，小動物呼吸機(jī)輔助通氣條件下，開胸以6-0聚丙烯(polypropylene)縫線結(jié)扎冠脈左前降支(left anterior descending, LAD)，術(shù)中監(jiān)測心電圖，以出現(xiàn)ST段抬高作為心梗成功標(biāo)志。建模成功后，直視下使用微量注射器于梗死心肌周邊注射標(biāo)記ADSCs(數(shù)量1.0×107，體積100 μl)，縫合關(guān)胸，觀察15 min后拔管脫機(jī)。

表1 掃描序列參數(shù)Tab 1 Detail parameters of the sequences

圖1 普魯士藍(lán)染色及透射電鏡結(jié)果。1A：普魯士藍(lán)染色光鏡圖片(×200)，藍(lán)色為鐵顆粒，標(biāo)記陽性率接近100%，藍(lán)染顆粒多位于細(xì)胞核周圍；1B：透射電鏡圖片(×25000)，黑色USPIO顆粒(箭頭)位于溶酶體中Fig 1 Results of Prussian blue staining and TEM.1A: Prussian blue staining (×200), blue particles around the nuclear could be visualized almost in all cells; 1B: 1B: The black USPIO particles (arrow) are showed in the lysosome by TEM(×25,000).

1.2.4 心臟磁共振成像示蹤標(biāo)記ADSCs

空白對照組及實驗組均行心臟磁共振成像，空白對照組時間不限，實驗組于注射標(biāo)記細(xì)胞后第3天進(jìn)行。SD大鼠于磁共振檢查前行腹腔麻醉，前胸備皮后粘貼電極片以實現(xiàn)心電門控。掃描采用3英寸線圈，參照美國心臟協(xié)會推薦的心臟標(biāo)準(zhǔn)解剖平面，選擇快速平衡穩(wěn)態(tài)進(jìn)動序列(fast imaging employ steadt state acquisition, FIESTA)和快速擾相位梯度回波(fast spoiled gradient recalled echo, FSPGR)序列進(jìn)行掃描，實驗組加掃2D MDE延遲強(qiáng)化序列(對比劑選用Gd-DTPA, 0.2 ml/100 g；具體參數(shù)見表1)。

1.2.5 評估SD大鼠左室心功能

圖2 正常SD大鼠(2A, HR 340 bpm)及急性心梗SD大鼠(2B, HR 357 bpm)心電圖，心梗鼠心電圖可見明顯ST段抬高性改變Fig 2 ECG of normal SD rat (2A, HR 340 bpm) and AMI SD rat (2B, HR 357 bpm).The latter showes the elevation of ST segment.

掃描完成后將實驗組和空白對照組Cine序列MR圖像傳輸至Report Card工作站，選取短軸兩腔心電影序列圖像，手動勾畫左室心肌內(nèi)膜輪廓，計算左室舒張末容積(left-ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、左室收縮末容積(left-ventricular end-systolic volume, LVESV)及左室射血分?jǐn)?shù)(leftventricular ejection fraction, LVEF)。

1.2.6 病理組織學(xué)檢查

磁共振成像后第2天處死SD大鼠，根據(jù)MR圖像及術(shù)中縫線切取梗死區(qū)心肌，行石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)，普魯士藍(lán)染色檢查USPIO分布。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用t檢驗比較實驗組和空白對照組SD大鼠的LVEDV、LVESV及LVEF，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異，雙側(cè)檢驗。統(tǒng)計分析使用SPSS l8.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs標(biāo)記及標(biāo)記有效性、安全性檢測

普魯士藍(lán)染色見干細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)染顆粒，部分聚集成團(tuán)，顆粒分布以核周和靠近細(xì)胞膜處較為明顯，偶見標(biāo)記陰性的細(xì)胞，細(xì)胞染色陽性率＞99%。透射電鏡于標(biāo)記細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見黑色顆粒聚集，主要位于各級溶酶體內(nèi)(圖1)。MTS比色分析法顯示培養(yǎng)基中USPIO濃度在0、10、20、40、80和160 μg Fe/ml時，各組細(xì)胞活性均保持在90%以上。

2.2 SD大鼠心梗建模及心肌內(nèi)注射移植標(biāo)記ADSCs

圖3 正常SD大鼠心臟MR圖像。3A：FSPGR Cine序列，短軸心圖像；3B：FEPGR Cine序列，長軸心圖像；3C：FIESTA Cine序列，短軸心圖像；3D：FIESTA Cine序列，長軸心圖像Fig 3 Cardiac MRI of normal SD rats.Short-axis (3A) and long-axis (3B) images with FSPGR Cine sequence，Short-axis (3C)and long-axis (3D) images with FIESTA Cine sequence.

圖4 實驗組SD大鼠心肌局部注射USPIO標(biāo)記干細(xì)胞后心臟MR圖像。4A：FIESTA Cine序列，短軸心圖像；4B：FEPGR Cine序列，短軸心圖像。左室前壁信號減低明顯可見(黃色箭頭)，部位與手術(shù)注射部位一致圖5 運動異常及延遲強(qiáng)化MR圖像。5A：FIESTA Cine序列圖像，黃色箭頭所指為電影序列上所見運動異常區(qū)域；5B：2D MDE序列圖像，黃色箭頭所指為延遲強(qiáng)化心肌。兩者位置相符Fig 4 Cardiac MRI of SD rats in experimental group injected USPIO-labled stem cells.Short-axis images with FSPGR Cine(4A) and FIESTA Cine (4B) sequence.The signal of anterior left ventricle decreases signifi cantly (yellow arrow), corresponding with the part of injection.Fig 5 MRI of abnormal movement and late enhancement.MR images with FIESTA Cine sequence demonstrating the area of abnormal movement (5A, yellow arrow), which is correspondecne with the late gadolium enhancement of myocardium (5B,yellow arrow) in 2D MDE images.

實驗組SD大鼠成功建模并完成心肌內(nèi)干細(xì)胞注射移植的共8只，建模成功率80%；另外2只由于術(shù)中大出血(n=1)和術(shù)后脫機(jī)未遂(n=1)而死亡。

結(jié)扎SD大鼠LAD后，相應(yīng)供血區(qū)域心肌顏色明顯加深變黑，心電圖出現(xiàn)ST段抬高改變(圖2)。梗死心肌周邊注射標(biāo)記ADSCs，注射部位心肌略鼓起，穿刺點部位少量出血。

2.3 SD大鼠心臟MR檢查

共有13只SD大鼠進(jìn)行心臟MR掃描，其中成功完成掃描共10只：空白對照組5只，完成FIESTA Cine和FSPGR Cine序列掃描；實驗組5只，完成FIESTA Cine和FSPGR Cine序列掃描，其中2只還完成2D MDE序列掃描；實驗組中另外3只由于心律不齊(n=2)和麻醉意外死亡(n=1)未能完成掃描。

FIESTA Cine和FSPGR Cine序列均可對SD大鼠心臟結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。5只空白對照組大鼠心臟室壁運動規(guī)律，心肌信號均勻，未見明顯信號減低區(qū)域(見圖3)。實驗組5只大鼠心肌內(nèi)均可見到明顯低信號區(qū)，位于左室前壁，與術(shù)中注射部位相符(見圖4)。其中2只進(jìn)行2D MDE延遲強(qiáng)化序列掃描的SD大鼠心肌內(nèi)可見延遲強(qiáng)化，位于左室前壁，與其電影序列圖像上室壁運動異常部位相一致(見圖5)。

2.4 心功能評估

實驗組和空白對照組LVEDV、LVESV、LVEF結(jié)果見表2。實驗組和空白對照組LVEDV、LVEF的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間的LVESV無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.5 病理組織學(xué)檢查

HE染色見實驗組大鼠梗死心肌呈凝固性壞死：細(xì)胞輪廓存在，但細(xì)胞核消失，普魯士藍(lán)染色于梗死心肌周邊可見局灶性分布藍(lán)染顆粒，非注射部位區(qū)域亦可見少量藍(lán)染顆粒分布。

表2 空白對照組及實驗組SD大鼠心功能測量結(jié)果Tab 2 Results of the cardiac function of SD rats in two groups

3 討論

本研究在轉(zhuǎn)染劑PLL的作用，將USPIO與ADSCs共孵育培養(yǎng)，高效且安全地實現(xiàn)了干細(xì)胞的磁共振標(biāo)記。構(gòu)建SD大鼠急性心梗模型，于梗死心肌周圍注射USPIO標(biāo)記干細(xì)胞，臨床1.5 T MR成像儀顯示USPIO標(biāo)記干細(xì)胞注射后局部心肌信號明顯減低，利用ReportCard軟件，可以計算SD大鼠心功能，研究結(jié)果證實了臨床1.5 T MR成像儀活體示蹤移植USPIO標(biāo)記干細(xì)胞并同時評估大鼠心功能的可行性。

3.1 活體MR成像示蹤USPIO標(biāo)記干細(xì)胞的可行性

移植干細(xì)胞通過在微環(huán)境作用下的定向分化和分泌相關(guān)細(xì)胞因子的方式對特定疾病進(jìn)行治療已經(jīng)成為近幾年的研究熱點[1,9]。在干細(xì)胞移植進(jìn)入體內(nèi)后，為了評估細(xì)胞療法的機(jī)制以及療效，研究人員需要有效地對移植細(xì)胞的分布、遷移甚至分化進(jìn)行監(jiān)測；在臨床應(yīng)用時，無創(chuàng)性的監(jiān)測方式是研究的首選。MRI沒有輻射，有著極佳的組織分辨率和空間分辨率，可同時獲得臨床價值極高的解剖及生理信息[10]，對深部組織的影像學(xué)特征進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的定位、定量分析，具有其他影像學(xué)技術(shù)不可比擬的優(yōu)越性，是一種非常理想的無創(chuàng)性影像學(xué)分析技術(shù)。而通過MR對比劑(如USPIO、SPIO等)對移植細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記，可使用MR成像儀對移植細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)、無創(chuàng)、重復(fù)性的多時間點監(jiān)測。

本研究在轉(zhuǎn)染劑PLL的作用下，將USPIO與ADSCs共孵育培養(yǎng)，通過干細(xì)胞自身吞噬作用實現(xiàn)磁共振顯像標(biāo)記。USPIO標(biāo)記干細(xì)胞移植進(jìn)入大鼠心肌后，心臟磁共振FIESTA和FSPGR Cine兩種序列圖像均可清楚顯示標(biāo)記細(xì)胞注射區(qū)域的信號強(qiáng)度比鄰近正常心肌和梗死心肌更低，呈“黑區(qū)”(black spots)，這為我們重復(fù)、無創(chuàng)性動態(tài)監(jiān)測標(biāo)記干細(xì)胞提供了可能。Kim等[11]以SPIO標(biāo)記人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)，然后將標(biāo)記干細(xì)胞于心梗建模后注射至心梗大鼠心肌內(nèi)，磁共振成像表明直到移植后第10周，仍可以在MR圖像上清楚顯示心肌內(nèi)低信號區(qū)。由于磁共振圖像的信號減低反映的是氧化鐵的信息，因此MR圖像上出現(xiàn)的信號減低并不能直接提示移植的標(biāo)記干細(xì)胞的存活，即會產(chǎn)生假陽性結(jié)果，導(dǎo)致過高估計移植后干細(xì)胞的存活率。除此之外，心肌出血含鐵血黃素的沉積也會帶來假陽性的問題。假陽性結(jié)果需要結(jié)合病理染色、免疫組化等多種方式加以排除。但亦有研究表明，標(biāo)記干細(xì)胞死亡后，其胞質(zhì)內(nèi)的氧化鐵顆粒短時間內(nèi)就可以通過特殊途徑離開心肌，因此部分學(xué)者認(rèn)為，心肌內(nèi)的信號減低可以代表存活的標(biāo)記干細(xì)胞[12]。移植細(xì)胞死亡后胞質(zhì)內(nèi)鐵顆粒的去向問題，尚有待進(jìn)一步的研究證實。

3.2 活體MR成像評價心功能的可行性

心臟MR的電影序列(Cine)得到的為亮血信號圖像，血液與心肌之間有著很高的對比度，是觀察心臟室壁運動、測量室壁厚度、計算射血分?jǐn)?shù)的理想選擇[12]。利用這一序列成像，可以實現(xiàn)無創(chuàng)檢測SD大鼠心功能、評估細(xì)胞療法治療效果的目的。本研究中，F(xiàn)IESTA和FSPGR兩種序列都可以清楚顯示心臟結(jié)構(gòu)，但FSPGR Cine圖像信噪比要優(yōu)于FIESTA序列。掃描參數(shù)上，F(xiàn)IESTA Cine序列可以實現(xiàn)的最小層厚為3.9 mm，而FSPGR序列為2.3 mm。因此本研究組選擇FSPGR Cine序列進(jìn)行SD大鼠心功能的計算，結(jié)果與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果相符[11,13-14]。在干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死的遠(yuǎn)期效果方面，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)所展示的心功能的改善程度不一，LVEDV、LVESV變化趨勢也不盡一致[11,13-14]；本研究組后續(xù)研究會對ADSCs移植治療SD大鼠急性心肌梗死后進(jìn)行多時間點監(jiān)測，以評估干細(xì)胞移植治療的有效性，明確心功能各參數(shù)的變化趨勢。

3.3 磁共振示蹤成像的不足與展望

磁共振成像的局限性在于敏感性較低，隨著移植干細(xì)胞的繁殖、分化和死亡，心肌內(nèi)氧化鐵的量和濃度會逐漸減低[15]，當(dāng)?shù)陀贛R成像敏感性時，磁共振活體示蹤檢測將不能實現(xiàn)。本研究中，病理檢查于非注射部位發(fā)現(xiàn)的少量藍(lán)染顆粒，磁共振圖像上卻沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的可檢測的信號強(qiáng)度改變。因此，為了實現(xiàn)長期監(jiān)測的目的，一方面可以通過改善MR掃描儀器軟、硬件條件提高成像敏感性，另外可以選擇其他更為敏感地示蹤手段。高敏感性的光學(xué)成像是種很好的選擇[16]，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)引入熒光素酶基因，需要成像時注射底物，通過底物與酶的作用實現(xiàn)發(fā)光。光學(xué)的高敏感性與MR的高時空分辨力，是一種理想的多模態(tài)成像模式，亦是本研究小組下一步的研究方向。

綜上所述，應(yīng)用臨床型1.5 T MR掃描儀對標(biāo)記干細(xì)胞進(jìn)行活體示蹤，同時行心功能測量是可行的，心臟磁共振成像在今后無創(chuàng)性監(jiān)測干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用中有著廣泛前景。

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