多黏菌素B聯(lián)合不同抗菌藥物抗耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的協(xié)同作用

顏秉興，孟英紅，孫迎軍，李建軍

濮陽市油田總醫(yī)院檢驗科濮陽457001

(2010-12-16收稿 責任編輯 徐春燕)

碳青霉烯類藥物因抗菌譜廣、穩(wěn)定性強、能抵御最常見的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌，已成為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的最后手段。在臨床治療中缺乏一種非常有效的藥物抵御碳青霉烯類多重耐藥菌株，兩種或多種抗菌藥物聯(lián)合應用有望產(chǎn)生協(xié)同效應。多黏菌素B(PB)、強力霉素(DOX)及利福平(RIF)等已單獨和(或)聯(lián)合應用于治療多重耐藥菌株［1］。作者采用棋盤微量稀釋法觀察了PB與幾種抗菌藥物聯(lián)合抵御耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與保存 2004年1月至2010年10月濮陽市油田總醫(yī)院保存的16株碳青霉烯類耐藥菌，其中肺炎克雷伯菌11株，大腸埃希菌5株，均來自不同患者。使用Vitek 2 Compact和API 20E條鑒定菌株。菌株于腦心浸液肉湯中－80℃保存，試驗前在含體積分數(shù)5%的綿羊血平板上轉種2次。

1.2 培養(yǎng)基、抗菌藥物和質(zhì)控菌 培養(yǎng)基:MH瓊脂和MH肉湯為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。抗菌藥物:PB、RIF、DOX、頭孢吡肟 (FEP)、頭孢曲松(CRO)、慶大霉素(GM)購自北京生物制品檢定所，亞胺培南(IMP)為默沙東公司產(chǎn)品。質(zhì)控菌:大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 部分抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)的計算

1.3.1 初篩 利用 Vitek 2 Compact對耐 IMP菌株進行篩選，初篩陽性菌株進一步檢測該菌對包括IMP在內(nèi)的各種藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。

1.3.2 棋盤微量稀釋法測定MIC及抗菌藥物聯(lián)合試驗 ①用96孔U型微量板(棋盤)分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC值。②根據(jù)測定的MIC值確定藥物的稀釋度，最高濃度為2×MIC。兩種藥物的稀釋分別在棋盤的縱列和橫列進行，即沿橫軸稀釋的藥物在縱列上各孔的藥物濃度相同，反之亦然。每個孔A藥和B藥各50μL，接種菌液100μL，最終藥物濃度為孔內(nèi)所加濃度的1/4，細菌接種量為5×105CFU/mL。35℃孵育24 h，肉眼觀察孔內(nèi)有無細菌生長。FICI=A藥聯(lián)合時的MIC/A藥單測時的MIC+B藥聯(lián)合時的MIC/B藥單測時的 MIC，判斷標準［2］:FICI＜0.5 為協(xié)同，0.5 ～4 為無關，＞4為拮抗。

1.3.3 藥敏判斷標準 對于PB，作者參考銅綠假單胞菌和不動桿菌屬的折點，把MIC≤2 mg/L定為敏感。利福平參考文獻［3］，其余均參考2010年CLSI文件［4］。

2 結果

2.1 不同來源菌株的MIC值 大多數(shù)菌株來自于痰和尿標本，除PB、RIF和DOX外，試驗菌株對其他抗菌藥物均耐藥，見表1。

表1 測試菌對試驗藥物的MIC值 mg/L

2.2 藥物聯(lián)合試驗結果 對于所有試驗菌株，PB與RIF或DOX在生理濃度下均存在協(xié)同效應，聯(lián)合后PB的MIC值降低3倍以上。只有1株菌PB與GM在一種聯(lián)合濃度發(fā)生協(xié)同效應，見圖1上。PB與FEP、IMP、CRO無明顯的協(xié)同效應，也未發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，圖1中、下為代表菌株的FICI分布圖。

圖1 代表菌株的FICI分布上:7號菌;中:1號菌;下:15號菌;黑色方框表示 FICI＞0.5，灰色方框表示有菌生長，白色方框表示無菌生長且FICI＜0.5。

3 討論

雖然PB從20世紀60年代應用于臨床并有良好的療效，但它的藥代動力學和藥效學尚未闡明［5］。目前，CLSI有關PB抵御腸桿菌科菌株的敏感性試驗尚無判斷標準。根據(jù)作者的經(jīng)驗，PB在該地區(qū)對多重耐藥銅綠假單胞菌和不動桿菌屬敏感性相對較高，故選擇PB作為該研究的基礎。

該研究結果顯示，除PB、RIF和 DOX外，試驗菌株對其他抗菌藥物均耐藥。對于所有試驗菌株，PB與RIF或DOX在生理濃度下均存在協(xié)同效應，聯(lián)合后PB的MIC值降低3倍以上。除1株菌PB與GM聯(lián)合出現(xiàn)范圍較窄的協(xié)同效應外，PB與其他試驗藥物未出現(xiàn)協(xié)同效應，也未出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。Bratu等［6］研究RIF與PB聯(lián)合抵御肺炎克雷伯菌時發(fā)現(xiàn)，16株菌中15株出現(xiàn)協(xié)同;IMP與PB聯(lián)合，10株出現(xiàn)協(xié)同，3株拮抗。作者的研究結果顯示RIF與PB聯(lián)合結果與Bratu等的結果基本相同，IMP與PB聯(lián)合結果差異很大，但與Elemam等［7］的報道相似。Wareham等［8］通過聯(lián)合用藥試驗研究多重耐藥鮑曼不動桿菌時發(fā)現(xiàn)，協(xié)同作用不具有普遍性，還可能存在菌株依賴性，因此各地區(qū)的結果會有差異，臨床醫(yī)生應以當?shù)氐脑囼灲Y果為依據(jù)。

綜上所述，PB與RIF、DOX體外聯(lián)合抵御耐碳青霉烯大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌存在協(xié)同作用。因為體內(nèi)體外的結果并非完全一致，還需要臨床醫(yī)生和微生物學者共同努力，進一步完善此類研究。

致謝 藥劑科李東副主任藥師給予技術指導。

［1］ Taccone FS，Rodriguez-Villalobos H，De Backer D.Successful treatment of septic shock due to pan-resistant Acinetobacter baumannii using combined antimicrobial therapy including tigecycline［J］.Eur JClin Microbiol Infect Dis，2006，25(4):257

［2］ Elemam A，Rahimian J，Mandell W.Infection with panresistant Klebsiella pneumoniae:a report of 2 cases and a brief review of the literature［J］.Clin Infect Dis，2007，49(2):271

［3］葉應嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京:東南大學出版社，2006.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:20th ed.CLSI/NCCLSM100-S20［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2010，Wayne，Pa.

［5］ Zavascki AP，Goldani LZ，Li J，et al.Polymyxin B for the treatment of multidrug-resistant pathogens:a critical review［J］.J Antimicrob Chemother，2007，60(6):1206

［6］ Bratu S，Tolaney P，Karumudi U，et al.Carbapenemaseproducing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn，NY:molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56(1):128

［7］ Elemam A，Rahimian J，Doymaz M，et al.In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae［J］.J Clin Microbiol，2010，48(10):3558

［8］Wareham DW，Bean DC.In vitro activity of polymyxin B in combination with imipenem，rifampicin and azithromycin versus multidrug resistant strains of Acinetobacter baumannii producing OXA-23 carbapenemases［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2006，5:10