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    復(fù)方大青葉注射液對(duì)體外培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞CXCR4啟動(dòng)子活性的影響*

    2011-09-18 01:56:48劉慧濤臧玉翠馬云云趙國強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:大青葉熒光素酶復(fù)方

    冷 弘,劉慧濤,臧玉翠,馬云云,李 敏,靳 靜,趙國強(qiáng)#

    1)洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室洛陽471000 2)南陽油田總醫(yī)院消化腎病科南陽473132 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州450001 4)河南省職工醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室鄭州451191

    (2011-04-24收稿 責(zé)任編輯 王 曼)

    大青葉是我國傳統(tǒng)中藥,屬于十字花科草本植物,味苦、性寒,具有清熱、解毒和涼血之功效,所含化學(xué)成分有靛藍(lán)、靛玉紅、色氨酮、3-羥苯基喹唑酮及有機(jī)酸類等。大青葉具有抗炎抗病毒和提高免疫力等作用[1],在抗流感、柯薩奇、乙型腦炎、單純皰疹及扁平疣等病毒方面效果顯著[2-6]。獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)所引起的傳染性疾病,在病毒感染過程中,CD4+T細(xì)胞是被攻擊的主要靶細(xì)胞,而 CXCR4則是HIV感染CD4+T細(xì)胞的關(guān)鍵輔助受體[7]。近年來,以輔助受體為靶點(diǎn)的抗AIDS藥物成為一個(gè)新的藥物設(shè)計(jì)目標(biāo),在HIV感染的早期階段起重要作用。作者以CXCR4啟動(dòng)子為靶點(diǎn),構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告載體,轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞系HT-H9細(xì)胞,觀察大青葉注射液對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面CXCR4基因啟動(dòng)子活性的影響,為復(fù)方大青葉注射液在抗AIDS方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人T淋巴細(xì)胞系HT-H9細(xì)胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。GloMax?96微孔發(fā)光檢測(cè)儀、pGEM-T Easy克隆載體、熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL4.17、4 ×dNTP、X-gal、IPTG、E4550 熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega公司;T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、NheⅠ、Marker DL2000均購自TaKaRa公司;DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司;G418、脂質(zhì)體購自Invitrogen公司;復(fù)方大青葉注射液由山東華信制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn),批號(hào)09081002,規(guī)格2 mL/支。

    1.2 目的基因的克隆及鑒定 按照GenBank中 發(fā)表的FJ642475 CXCR4啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)引物,分別加入KpnⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn),上游引物:5’-CGG TACCAAGCACTATTCGCGAATTGGTTAC-3’,下游引物:5’-TGCTAGCGGTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3’。引物由上海生工生物公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物大小為876 bp。取健康志愿者靜脈血,F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,提取人基因組 DNA。PCR擴(kuò)增體系:10×buffer 5μL,上、下游引物各0.5 mL,高保真 Taq酶 2 U,4×dNTP 2 μL,人基因組DNA 2μL,去離子水補(bǔ)足50μL;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,循環(huán)25次;72℃延伸5 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳,驗(yàn)證片段大小。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接與pGEM-T Easy載體進(jìn)行連接,16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,篩選陽性克隆,抽提重組質(zhì)粒pGEM-T-CXCR4,經(jīng)PCR和雙酶切消化鑒定。

    1.3 重組報(bào)告載體的構(gòu)建 酶切報(bào)告基因載體pGL4.17和重組質(zhì)粒pGEM-T-CXCR4,得到線性化的載體與目的基因,膠回收雙黏片段,采用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,接種于含氨芐的LB平板,篩選陽性菌落,獲得陽性報(bào)告載體pGL4.17-CXCR4。經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,并進(jìn)一步測(cè)序確證。

    1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞,轉(zhuǎn)染前以3×105個(gè)/孔接種于24孔板上,用脂質(zhì)體法分別將質(zhì)粒pGL4.17及 pGL4.17-CXCR4轉(zhuǎn)入 HT-H9細(xì)胞,于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2和飽和濕度下培養(yǎng),經(jīng)800 mg/L G418篩選2周獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,然后在200 mg/L G418壓力下擴(kuò)大培養(yǎng)。

    1.5 實(shí)驗(yàn)分組 復(fù)方大青葉注射液作為成藥,其原液含生藥質(zhì)量濃度為1 000 g/L,根據(jù)其成人推薦臨床用量(2~4 mL/次,1~2次/d)折算出細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)應(yīng)的等效劑量,按照成人60 kg體質(zhì)量折算,用注射用水稀釋,分高劑量與低劑量,換算后細(xì)胞培養(yǎng)的劑量分別為100 mg/L和200 mg/L。分別以用高、低劑量復(fù)方大青葉注射液處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為高、低劑量實(shí)驗(yàn)組,以未加任何處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組,以注射用水處理的轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為注射水對(duì)照組,同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的HT-H9細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組。每組各設(shè)10個(gè)復(fù)孔,在相應(yīng)條件下處理24 h后進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

    1.6 熒光素酶活性檢測(cè) 收集各組細(xì)胞,離心去培養(yǎng)液,PBS洗滌后收集細(xì)胞,按照E4550熒光素酶檢測(cè)試劑盒操作說明,每孔加入150μL Cell Culture Lysis Reagent裂解細(xì)胞,室溫作用15 min,吸取20 μL裂解后的液體至96孔板,用GloMax96微孔發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)各組熒光素酶熒光值。每孔重復(fù)測(cè)3次,取平均值作為該孔細(xì)胞熒光素酶活性值。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 SPSS 13.0處理數(shù)據(jù),5組熒光素酶活性的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒p GEM-T-CXCR4的鑒定 CXCR4啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增片段與預(yù)期相符(圖1)。將擴(kuò)增產(chǎn)物插入pGEM-T Easy載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,獲得陽性克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒大小與計(jì)算理論值大小一致(圖2)。

    2.2 p GL4.17-CXCR4的鑒定 將CXCR4啟動(dòng)子序列亞克隆入 pGL4.17載體,篩選陽性克隆采用KpnⅠ/NheⅠ雙酶切鑒定,電泳結(jié)果符合預(yù)期大小,證實(shí)啟動(dòng)子序列正確插入(圖3)。測(cè)序結(jié)果證明重組的pGL4.17-CXCR4序列與設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列完全一致。

    2.3 各組細(xì)胞熒光素酶活性檢測(cè) 見表1。

    表1 各組CXCR4熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果

    3 討論

    復(fù)方大青葉注射液屬于中成藥,以大青葉為主,輔以金銀花、羌活、拳參、大黃配制而成,其藥物活性成分及作用靶點(diǎn)眾多,抗病毒效應(yīng)的作用機(jī)制也十分復(fù)雜,是常用的清熱解毒類中藥。在已有的大青葉抗病毒研究中,劉盛等[2]發(fā)現(xiàn)大青葉注射液對(duì)流感病毒有直接抑制作用;李小青等[8]發(fā)現(xiàn)大青葉注射液對(duì)柯薩奇病毒引起的小鼠病毒性心肌炎效果明顯,能夠有效改善和保護(hù)心肌細(xì)胞;喬鳳霞[9]采用大青葉注射液治療單皰病毒性角膜炎,療效顯著;高?。?]自制乙腦合劑(大青葉、石膏、知母等)聯(lián)合西藥治療重癥乙腦,療效優(yōu)于單純西藥治療。上述研究結(jié)果表明大青葉注射液在抗病毒方面作用廣泛。

    CXCR4與CCR5屬于趨化因子受體家族成員,與相應(yīng)配體結(jié)合參與體內(nèi)多種生理病理進(jìn)程(如白細(xì)胞趨化、免疫調(diào)節(jié)及新生血管形成),參與細(xì)胞增殖和代謝等。CXCR4與CCR5是HIV-Ⅰ感染CD4+T細(xì)胞的關(guān)鍵輔助受體[10],在HIV-Ⅰ進(jìn)入靶細(xì)胞過程中起重要作用。輔助受體拮抗劑的開發(fā)成為抗AIDS治療的重大突破[11]。目前已有的 CXCR4拮抗劑中,AMD070正處于Ⅱ期臨床研究階段,KRH-1636在阻斷HIV-Ⅰ的復(fù)制方面效果明顯[12]。既然輔助受體的封閉能夠達(dá)到阻止HIV感染及其在細(xì)胞間的傳播作用,下調(diào)二者的表達(dá)理論上應(yīng)能夠阻止HIV入侵宿主細(xì)胞,達(dá)到有效防治AIDS的目的[13]。作者通過復(fù)方大青葉注射液對(duì)體外培養(yǎng)HT-H9細(xì)胞中CXCR4啟動(dòng)子活性作用的觀察,了解其是否能夠通過作用于CXCR4啟動(dòng)子,下調(diào)CXCR4蛋白的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗AIDS活性。

    作者首先構(gòu)建了含人CXCR4啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)載體 pGL4.17-CXCR4,以其轉(zhuǎn)染 HT-H9細(xì)胞,測(cè)定熒光素酶活性,以此來觀察CXCR4啟動(dòng)子的表達(dá)。結(jié)果顯示,空白對(duì)照組熒光素酶平均值均大于15 000,遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組,說明載體構(gòu)建成功,且啟動(dòng)子調(diào)控后續(xù)基因表達(dá),熒光素酶基因得以激活,檢測(cè)熒光素酶活性可以代表CXCR4啟動(dòng)子活性。復(fù)方大青葉注射液高劑量實(shí)驗(yàn)組和低劑量實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶熒光值明顯低于空白對(duì)照組,提示復(fù)方大青葉注射液可以降低體外培養(yǎng)的HT-H9細(xì)胞CXCR4啟動(dòng)子活性,減少CXCR4啟動(dòng)子的表達(dá),具有潛在的抗HIV-Ⅰ的作用。

    在腫瘤研究領(lǐng)域,2001年 Muller等[14]首次報(bào)道CXCR4和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān),隨后越來越多的研究[15-17]表明CXCR4與多種腫瘤遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。因此,復(fù)方大青葉注射液是否能通過降低CXCR4的表達(dá),以達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)以及減少轉(zhuǎn)移的目的,也值得進(jìn)一步探討。

    總之,復(fù)方大青葉注射液作為一種毒副作用小、價(jià)格低廉的傳統(tǒng)中藥,深入研究其作用機(jī)制,充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì),在AIDS和腫瘤的防治上必將有非常廣闊的發(fā)展前景。

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