養(yǎng)陰清熱法對放療后食管癌大鼠c-myc蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響*

洪永貴，黃 濤，鄭玉玲，王俊生

1)安陽市腫瘤醫(yī)院內(nèi)科安陽455000 2)黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院鄭州450005 3)河南中醫(yī)學(xué)院鄭州450008

(2010-12-23收稿 責(zé)任編輯 姜春霞)

食管癌放療后，中醫(yī)病機(jī)則以陰津不足、熱邪內(nèi)留為主，痰淤互結(jié)為輔，治療上當(dāng)以養(yǎng)陰清熱為主，輔以化痰散結(jié)、祛淤解毒。作者選用放療后大鼠食管癌模型，以養(yǎng)陰清熱立法，應(yīng)用地黃管食通口服液治療，探討?zhàn)B陰清熱法對放療后食管癌大鼠細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白c-myc表達(dá)的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用Wistar大鼠，體質(zhì)量(120±10)g，2個月齡，雌雄各半，由河南省實驗動物中心提供，合格證號:0001645。在該中心清潔級(SPF)環(huán)境下常規(guī)飼料(消毒后)喂養(yǎng)。

1.2 實驗藥品 甲基戊基亞硝胺(MANA)由華西醫(yī)科大學(xué)提供，用玉米油配成體積分?jǐn)?shù)0.2%的液體。地黃管食通口服液(以下簡稱管食通，為鄭玉玲教授經(jīng)驗方，主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、冬凌草和山豆根等組成):10 mL/支，河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供，含生藥比例為1-1。實驗濃度依次為低劑量含生藥0.5 kg/L(為臨床用藥劑量的10倍)、中劑量含生藥1.0 kg/L、高劑量含生藥1.5 kg/L，均為混懸液。六味地黃丸(由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓等組成):河南宛西制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號:050114，臨床用量9 g/d，用羧甲基纖維素鈉配成含生藥0.45 kg/L的混懸液(為臨床用藥劑量的30倍)。戊巴比妥鈉:上海第一制藥廠生產(chǎn)。鹽酸氯胺酮注射液:上海第二制藥廠生產(chǎn)。

1.3 主要試劑和儀器 鼠抗c-myc單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，批號G2205;免疫組織化學(xué)試劑盒為美國 Zymed公司產(chǎn)品，批號50181263(鼠抗);DAB顯色試劑盒，批號50281313，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為華美生物工程公司產(chǎn)品，批號106055。DT-300A型電子天平，上海醫(yī)用激光儀器廠;雙目光學(xué)顯微鏡和顯微照相機(jī)，日本Olympus公司;Co60照射治療機(jī)，上海醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);DQP-9001電腦切片機(jī)，上海醫(yī)用儀器廠。

1.4 動物模型的建立、分組及給藥 健康Wistar大鼠130只，按隨機(jī)數(shù)字法抽取20只作為空白對照組(空白組)。其余110只動物均皮下注射MANA 5 mg/(kg·d)，1次/周，連續(xù)20周，末次注射MANA后，按隨機(jī)數(shù)字法抽取20只大鼠作為食管癌造模組(食管癌組)，并將空白組、食管癌組每組隨機(jī)選取2只，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(1 g/kg，4 mL/kg)處死。取食管縱切置于40 g/L多聚甲醛緩沖液固定后，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，食管癌組抽取大鼠經(jīng)病理學(xué)檢查均證實為食管癌，造模成功。剩余90只造模大鼠經(jīng)氯胺酮腹腔注射麻醉［0.1 g/(kg·d)，2 mL/(kg·d)］，應(yīng)用 Co60放射治療機(jī)進(jìn)行大鼠食管局部照射，劑量為2 Gy/d，共5 d。末次照射24 h后，將放療動物隨機(jī)均分為5組，單放組［蒸餾水10 mL/(kg·d)］、六味組［六味地黃丸4.5 g/(kg·d)］、低劑量組［地黃管食通口服液5 g/(kg·d)］、中劑量組［地黃管食通口服液10 g/(kg·d)］和高劑量組［地黃管食通口服液15 g/(kg·d)］，各組動物每周測體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)節(jié)給藥劑量。實驗結(jié)束，所有大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)處死，行相關(guān)檢查。放療后用藥期間，食管癌組和單放組各有2只大鼠死亡，六味組有1只死亡;管食通各組均無大鼠死亡。

1.5 檢測指標(biāo) 所有標(biāo)本離體后1 h內(nèi)采集，取大鼠咽至胃的食管切成縱條，每例標(biāo)本經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片制片，用SP法測定cmyc蛋白表達(dá)以及TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，并計算凋亡指數(shù)。c-myc表達(dá)的測定主要步驟:常規(guī)脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2甲醇溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶，高壓修復(fù)抗原，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，不洗;滴加一抗 c-myc，4℃過夜，PBS漂洗，滴加二抗37℃20 min，滴加S-A/HRP 37℃20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，透明封片，顯微鏡觀察。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):c-myc蛋白陽性反應(yīng)均位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，均呈棕黃色顆粒，每張切片觀察5個200倍視野，每個視野計數(shù)500個細(xì)胞，根據(jù)顯色有無及陽性細(xì)胞多少可分為4個等級。陰性(－)，整個切片未見陽性染色;弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)＜25%;中度陽性()，陽性細(xì)胞數(shù)25% ～50%;強(qiáng)陽性()，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。TUNEL法主要步驟:石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水和蛋白酶K室溫濕化，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，封片，顯微鏡觀察。全部操作按試劑盒說明書操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):凋亡細(xì)胞核呈棕黃色;每張切片觀察5個200倍視野，每個視野計數(shù)500個細(xì)胞，計算凋亡細(xì)胞百分比，即為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。各組c-myc表達(dá)水平的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗;AI比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠c-myc蛋白表達(dá)情況 空白組僅見散在細(xì)胞核棕色著染，且顏色較淡;食管癌組大多數(shù)細(xì)胞核呈棕黃色，著色深，尚可見棕褐色的細(xì)胞核;中劑量組胞核呈棕黃色，著色明顯比食管癌組淺。見圖1和表1。

2.2 各組大鼠細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 空白組可見少數(shù)細(xì)胞核棕色著染，大部分細(xì)胞核呈淺藍(lán)色;食管癌組僅見散在細(xì)胞核呈棕黃色，著色淺;中劑量組胞核呈棕黃色，著色明顯較深。見表2和圖2。

圖1 各組大鼠c-myc蛋白表達(dá)情況(SP，×200)A:空白組;B:食管癌組;C:中劑量組。

表1 各組大鼠c-myc表達(dá)比較 例

表2 各組大鼠AI比較

圖2 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×200)A:空白組;B:食管癌組;C:中劑量組。

3 討論

細(xì)胞凋亡最早由Kerr等［1］提出，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因控制的細(xì)胞程序性死亡。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。很多抗癌藥是通過誘發(fā)腫瘤凋亡來發(fā)揮作用的。

c-myc是一個具有多種功能的癌基因，位于人的第8號染色體上，編碼2個磷酸蛋白(P62和P67)，定位于線粒體內(nèi)水溶性蛋白質(zhì)，穩(wěn)定地結(jié)合于線粒體內(nèi)膜，不能通過內(nèi)膜［2］，是參與正常細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和分化的一個原癌基因，能調(diào)控細(xì)胞周期，具有誘導(dǎo)增殖和凋亡的雙重作用［3］，在腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移等過程中可發(fā)揮重要作用，是與食管病變程度相關(guān)的蛋白之一［4］。近年有學(xué)者［5］開展了c-myc與核糖體蛋白反饋調(diào)控的研究，確認(rèn)核糖體蛋白L11是m-cyc的負(fù)反饋調(diào)控物，可以抑制細(xì)胞內(nèi)c-myc的轉(zhuǎn)錄活性，作為轉(zhuǎn)錄因子，myc有與大量基因組座位結(jié)合的能力［6］。李晟磊等［7］認(rèn)為c-myc過度表達(dá)可能是食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，對食管癌患者預(yù)后的判斷有重要參考價值。吳名耀等［8］通過觀察70例食管癌切除新鮮標(biāo)本的上切緣正常黏膜、癌旁食管黏膜上皮和食管原位癌組織中hTERT和c-myc蛋白的表達(dá)情況，認(rèn)為癌旁黏膜上皮c-myc的上調(diào)促進(jìn)了hTERT的表達(dá)。

依據(jù)養(yǎng)陰清熱法組方的地黃管食通口服液主要用于治療食管癌放療中或放療后患者，經(jīng)多年應(yīng)用，能減輕放射線的不良反應(yīng)，并與放療起協(xié)同作用［9］。

該實驗結(jié)果顯示，c-myc蛋白表達(dá)，與空白組比較，高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與食管癌組比較，地黃管食通口服液各組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;與單放組比較，只有高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組均見有細(xì)胞凋亡，且放療組和各藥物治療組與空白組及食管癌組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;六味組與單放組、低劑量組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;地黃管食通中劑量組及高劑量組與單放組和六味組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;中劑量組與低劑量組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組與中劑量組及低劑量組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，養(yǎng)陰清熱法(地黃管食通口服液)可降低食管癌放療后大鼠c-myc蛋白表達(dá)水平，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示其防治食管瘤放療后復(fù)發(fā)的機(jī)制可能是通過降低c-myc表達(dá)水平，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡所實現(xiàn)。

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［6］ Kim J，Chu J，Shen X，et al.An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells［J］.Cell，2008，132(6):1049

［7］李晟磊，崔晶，陳俊濤，等.c-myc和p27在食管鱗狀上皮癌變過程中的表達(dá)及其意義［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，21(3):168

［8］吳名耀，吳賢英，莊楚香.hTRT和C-myc的表達(dá)在食管上皮增生和癌變過程中的意義［J］.癌變·畸變·突變，2003，15(1):17

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