大黃黃連瀉心湯、理中丸對消炎痛型及水浸應激型胃潰瘍寒熱證模型大鼠胃組織EGF、TGF－α含量的影響

李冀，謝田，于海，蔣蕾，趙偉國，趙雪瑩，畢珺輝，柴劍波

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

消化性潰瘍(PU)包括胃潰瘍(GU)和十二指腸潰瘍(DU)，因其形成與胃酸/胃蛋白酶的消化作用有關而得名。中醫(yī)學在治療消化性潰瘍方面積累了大量寶貴的經(jīng)驗，在臨床治療中取得滿意的療效。但現(xiàn)代醫(yī)學手段研究中醫(yī)藥的模式，缺乏中醫(yī)理論的精髓要素，難以揭示中醫(yī)藥辨證論治的內涵。證是中醫(yī)學特有的概念，對于證本質的研究被認為是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的關鍵問題，隨著研究的日趨深入許多新的理論方法被應用于研究之中，病證結合和方證相關(相應)思想逐漸從臨床融入基礎研究領域，并為中醫(yī)證的研究及中醫(yī)現(xiàn)代化研究提供新的途徑。

本研究主要以病證結合和方證相關思想為基礎，采用國內外較為公認的水浸應激型和消炎痛型消化性潰瘍模型，結合寒熱因素，建立消化性潰瘍寒、熱模型，并通過酶聯(lián)免疫方法探究寒性方劑大黃黃連瀉心湯、熱性方劑理中丸對消炎痛型及水浸應激胃潰瘍寒熱證模型大鼠胃組織中EGF和TGF－α含量的影響。課題組前期實驗亦取得顯著成果［1－3］。

1 實驗材料及藥物制備

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠，黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心(GLP)，合格證號SCXK(京)2007－0001。

1.2 實驗用藥 熱因素:辣椒水、乙醇混懸液。將辣椒粉過120目篩，溶入60%無水乙醇中，配制成8%干辣椒粉的乙醇混懸液。寒因素:氫氧化鈉(NaOH)，電子天平稱取6g白色顆粒狀NaOH，溶入500mL雙蒸水中，配成0.3mol/L濃度。冰水:冷凍保存，使用時提前取出溶化。大黃黃連瀉心湯、理中丸均按原方藥量及比例制備，其中，大黃黃連瀉心湯濃縮至每毫升含0.5g生藥量，理中丸濃縮至每毫升含1g生藥量的液體，冰箱存儲備用。

1.3 主要儀器設備

Sgnergy HT全自動酶標儀(Anthos Labtee instruments made in Austria);PL202－S/00型電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)。

1.4 實驗試劑 甲醛(分析純，天津市博大化工有限公司);醫(yī)用酒精(黑龍江華潤酒精有限公司);乙醚(分析純級，上?；瘜W試劑采購供應站);鹽酸(上海化學試劑采購供應站);生理鹽水(哈藥集團制藥六廠);冰乙酸(上?；瘜W試劑采購供應站);NaOH(天津市博大化工有限公司);TGF－α試劑盒(美國RD公司);EGF試劑盒(美國RD公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組給藥 將各組動物分別按上述胃寒、熱證造模方法［4］，進行寒熱因素灌胃，給予相應造模劑;模型組及空白對照組則給予等體積生理鹽水，連續(xù)7天。寒熱因素造模后，將第一步中受試大鼠(除空白對照組)，在各自組別內再按體重隨機分成3組，每組10只，即:

寒水(消)組分為:寒水(消)組、寒水(消)大組、寒水(消)理組;

熱水(消)組分為:熱水(消)組、熱水(消)大組、熱水(消)理組;

單寒組分為:單寒組、單寒大組、單寒理組;

單熱組分為:單熱組、單熱大組、單熱理組。

按組別，各給藥組分別給予相應治療方劑，大黃黃連瀉心湯劑量1.8g/kg，理中丸劑量3.6g/kg每天2次;單水(消)組、熱水(消)組、寒水(消)組、單熱組、單寒組及空白對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)4天;末次給藥后將受試大鼠禁食不禁水30h(注意勿使動物食入糞便和墊料等雜物，以免影響造模結果)，并于消炎痛及水浸應激造模開始前30min，再給藥1次。

2.2 取材 分別于消炎痛腹腔注射7h后，水浸應激7h后，處死動物，準確稱取大鼠胃組織0.3～0.4g，按重量體積比，加9倍的生理鹽水制成10%的勻漿，2 500r/min離心10min，取上清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 測定 大鼠胃組織中EGF和TGF－α的含量測定按照試劑盒說明書進行。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)通過SPSS 13.0軟件包用單因素方差分析(one－way ANOVA)LSD或S－N－K法進行兩兩比較檢驗，用(±s)表示結果。

4 實驗結果

4.1 寒熱方劑對水浸應激型胃潰瘍大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響 結果見表1～3。

表1 水浸應激型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表1 水浸應激型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與寒水組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，與熱水組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)寒水 8 24.31 ±6.66＊＊ 33.24 ±12.43＊＊10 46.16 ±11.20 73.15 ±14.89熱水 9 23.19 ±9.18＊＊ 10.98 ±4.04＊＊單寒 10 32.01 ±5.67＊＊△ 58.45 ±17.92△△單熱 10 30.17 ±3.96＊＊★ 56.64 ±20.61★★單水 10 33.08 ±10.05＊△★ 51.83 ±20.93＊△★★空白

表2 寒熱方劑對水浸應激型胃潰瘍寒、熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表2 寒熱方劑對水浸應激型胃潰瘍寒、熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與寒水組比較，△△P ＜0.01，與熱水組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 n EGF(pg·mL－1) TGF － α (pg·mL－1)寒水 8 24.31 ±6.66 33.24 ±12.43＊＊8 21.95 ±2.58 15.51 ±5.91寒水大 7 20.95 ±4.58 28.94 ±5.83寒水理 9 43.94 ±17.88△△ 69.29 ±29.14△△熱水 9 23.19 ±9.18 10.98 ±4.04熱水大 8 34.74 ±11.93* 64.33 ±12.78＊＊熱水理

由表1可知:在EGF方面，各模型組與空白組比較EGF含量均明顯下降，有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01);寒水與單水、單寒比較有顯著性差異(P＜0.05);熱水較單水、單熱EGF含量明顯下降，有顯著性差異(P＜0.05)。在TGF－α方面，寒水、熱水、單水與空白組比較含量明顯降低，有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01);寒水與單水、單寒比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，熱水與單水、單熱比較有顯著性差異(P＜0.01)。

從表2可知:在EGF方面，寒水、熱水間無明顯差異(P＞0.05);經(jīng)熱性方劑理中丸治療后，寒水理與寒水比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01);熱水大與熱水比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05)。在TGF－α方面，熱水含量低于寒水，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);經(jīng)熱性方劑理中丸治療后，寒水理與寒水比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01);經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，熱水大與熱水比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)。

表3 寒熱方劑對水浸應激型胃潰瘍單寒、單熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表3 寒熱方劑對水浸應激型胃潰瘍單寒、單熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與單寒組比較，*P＜0.05，與單熱組比較，△P＜0.05。

組別 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)10 32.01 ±5.67 58.45 ±17.92單寒大 8 32.48 ±9.17 54.45 ±16.03單寒理 9 43.68 ±16.44* 62.24 ±11.18單熱 10 30.17 ±3.96 56.64 ±20.61單熱大 8 39.48 ±10.56△ 68.25 ±8.60單熱理單寒8 27.94 ±8.18 67.23 ±13.59

從表3可知:在EGF方面，單寒理與單寒比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，單熱大與單熱比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05)。在TGF－α方面，單寒與單熱比較(P＞0.05);經(jīng)大黃黃連瀉心湯和理中丸治療后，各組差異仍不顯著(P＞0.05)。

4.2 寒熱方劑對消炎痛型胃潰瘍大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響 結果見表4～6。

表4 消炎痛型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表4 消炎痛型胃潰瘍寒、熱證模型間大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與空白組比較，＊＊P ＜0.01;與寒消比較，★P ＜0.05，★★P＜0.01;與熱消組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與單寒組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)寒消 9 25.37 ±6.81＊＊ 32.88±9.15＊＊△△10 47.13 ±8.68 72.89 ±11.66熱消 9 23.72 ±6.32＊＊ 14.02±4.10＊＊★★單寒 10 32.62 ±7.90＊＊★ 56.18±12.20＊＊單熱 9 29.87 ±5.35＊＊# 30.11 ±8.29＊＊△△##單消 9 32.32 ±6.87＊＊★# 52.73 ±12.59＊＊★★##空白

由表4可知:在EGF方面，各組大鼠胃組織EGF含量均明顯低于空白組，有極顯著性差異(P＜0.01);寒消與單寒、單消，熱消與單消、單熱比較，EGF含量均明顯降低，比較具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。在TGF－α方面，各組大鼠胃組織TGF含量均明顯低于空白組，有極顯著性差異(P＜0.01);寒消與單消、單熱比較，熱消與單消、單熱比較有顯著性差異(P＜0.01);熱消含量明顯低于寒消，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表5 寒熱方劑對消炎痛型胃潰瘍寒、熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表5 寒熱方劑對消炎痛型胃潰瘍寒、熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與寒消組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與熱消組比較，△△P＜0.01。

組別 n EGF(pg·mL－1) TGF － α (pg·mL－1)寒消 9 25.37 ±6.81 32.88 ±9.15△△8 21.59 ±5.77 12.10 ±4.88寒消大 8 22.59 ±7.29 30.60 ±8.44寒消理 8 40.72 ±4.32＊＊ 62.90 ±11.98＊＊熱消 9 23.72 ±6.32 14.02 ±4.10熱消大 8 38.41 ±4.29△△ 59.69 ±11.87△△熱消理

由表5可知:在EGF方面，經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，熱消大與熱消比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05)。寒消大與寒消、熱消理與熱消各組比較，胃組織 EGF含量無顯著性差異(P＞0.05)。在TGF－α方面，寒消與熱消比較TGF含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)熱性方劑理中丸治療后，寒消理與寒消比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01);經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，熱消大與熱消比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)。

表6 寒熱方劑對消炎痛型胃潰瘍單寒、單熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

表6 寒熱方劑對消炎痛型胃潰瘍單寒、單熱證大鼠胃組織EGF和TGF－α含量的影響(±s)

注:與單熱組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01;與單寒組比較，△△P＜0.01。

組別 n EGF(pg·mL －1) TGF － α(pg·mL －1)9 27.77 ±7.20 27.17 ±8.90 10 32.62 ±7.90 56.18 ±12.20單寒大 9 30.36 ±6.68 54.57 ±14.79單寒理 9 42.99 ±6.18△△ 67.33 ±10.52△單熱 9 29.87 ±5.35 30.11 ±8.29△△單熱大 9 37.83 ±9.29★ 59.30 ±8.20★★單熱理單寒

由表6可知:在EGF方面，經(jīng)熱性方劑理中丸治療后，單寒理與單寒比較EGF含量均明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01);經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，單熱大與單熱比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05)。在TGF－α方面，單寒與單熱比較TGF－α含量明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01);經(jīng)熱性方劑理中丸治療后，單寒理與單寒比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)寒性方劑大黃黃連瀉心湯治療后，單熱大與單熱比較含量明顯升高，有顯著性差異(P＜0.01)。

5 討論

潰瘍愈合是一個十分復雜的過程，受多種因子及其受體的調控，關系密切的細胞因子是轉化生長因子α(TGF－α)、血管內皮生長因子等。EGF可以抑制胃酸分泌，增加胃黏膜血流量，增加黏膜DNA合成，促進胃黏膜上皮細胞增殖而進行細胞保護［5］。TGF－α產生于整個胃腸道，尤以胃竇黏膜表達量高，參與胃腸道調節(jié)黏膜上皮的更新和黏膜損傷的修復，是維持黏膜完整性的重要介質，被稱為“黏膜完整肽”［6］。動物實驗表明:大鼠胃潰瘍在愈合過程中，TGF－α、EGF兩種生長因子的表達是逐漸增強的，也就是說大鼠胃潰瘍的愈合與兩種生長因子的表達是一致的。其中TGF－α對調控局部胃結構的重建起決定性作用［7］。

本研究表明，水浸應激型胃潰瘍寒、熱證造模皆可使胃黏膜中EGF、TGF－α含量減少，容易導致應激型潰瘍復發(fā);施加寒、熱因素對EGF影響不明顯;TGF－α在應激型潰瘍熱證上反應明顯，說明應激型潰瘍熱證可能使胃黏膜完整性的破壞程度加重，應激型潰瘍的愈合能力降低。消炎痛型胃潰瘍寒、熱證造模皆可使胃黏膜中EGF、TGF－α含量減少，但施加熱因素后TGF－α含量明顯降低，提示TGF－α可作為臨床胃潰瘍熱證的微觀指標。寒性方劑大黃黃連瀉心湯預防水浸應激型潰瘍熱證的作用機制可能與刺激胃黏膜EGF、TGF－α釋放有關;對消炎痛型胃潰瘍熱證模型有選擇性，升高EGF、TGF－α含量可能是大黃黃連瀉心湯治療胃潰瘍熱證的作用機制。熱性方劑理中丸預防水浸應激型潰瘍寒證作用機制可能與刺激胃黏膜EGF、TGF－α釋放有關;治療消炎痛型胃潰瘍寒證的作用機制可能與刺激胃粘膜EGF、TGF－α釋放，從而升高EGF TGF－α含量有關，體現(xiàn)了方證相應的證治規(guī)律。

綜上所述，通過寒熱不同性質的方劑對施加寒熱因素的消炎痛型和水浸應激型胃潰瘍模型大鼠胃組織中EGF和TGF－α含量影響的比較，說明通過“方證相應”理論驗證“病證結合”的胃潰瘍寒熱模型復制成功，大黃黃連瀉心湯可以治療熱性消炎痛型胃潰瘍，預防熱性水浸應激型胃潰瘍的形成;理中丸可以治療寒性消炎痛型胃潰瘍，預防寒性水浸應激型胃潰瘍的形成，均可通過升高大鼠胃組織中EGF和TGF－α的含量而實現(xiàn)，證明本實驗所采用的“病證結合”的胃潰瘍造模方法確切可行。

［1］ 李冀，柴劍波，畢珺輝，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對胃寒證、胃熱證模型大鼠基礎代謝的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38(5):55－57.

［2］ 李冀，謝田，柴劍波，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對幽門結扎型、醋酸涂抹型胃潰瘍寒熱證模型大鼠血清NT含量的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(1):38 －41.

［3］ 畢珺輝，李冀，謝田，等.大黃黃連瀉心湯、理中丸對四種模型胃潰瘍寒熱證大鼠血清 PAF含量的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(2):51－55.

［4］ 柴劍波，趙雪瑩，畢珺輝，等.寒、熱方劑對醋酸涂抹型胃潰瘍寒、熱證模型大鼠血清VEGF、胃組織bFGF含量的影響［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(3):122 －124.

［5］ Brzozowski T，Konturek S T，Majka J，et al.Epidermalgrowth factor polyamines，and prostaglandins in healing of stress－indu－cel gastric lesions in rats.Dig Dis Sci，1993，38:276.

［6］ Tamawski A，Santos A M，Hanke S，et al.Quality of gastric ulcer healing is it influenced by antiulcer drugs.Scand J Gastroenterol Suppl，1995，208:9 －13.

［7］ 劉紅.轉化生長因子α對消化性潰瘍的修復作用研究進展［J］.國際消化病雜志，2006，26(5):320 －321.