自噬在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用

洪 遠(yuǎn)， 郭松雪， 張建民

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江杭州310009)

自噬(autophagy)是真核細(xì)胞在營養(yǎng)與能量缺乏情況下，通過分解亞細(xì)胞成分提供生物合成原料，使蛋白質(zhì)和細(xì)胞器得以循環(huán)利用的一種降解代謝途徑，同時調(diào)控線粒體更新及過氧化物酶體等，從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。近年對于自噬現(xiàn)象與疾病相互聯(lián)系的研究逐漸增多，現(xiàn)就自噬在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用做一綜述，以期為創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供新的途徑及思路。

1 自噬

1.1 概述 自噬可以分為大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)及分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone－mediated autophagy)。通常意義上，重點集中于大自噬，作為典型普遍的自噬。自噬在形態(tài)學(xué)上的過程變化可歸納為，即將發(fā)生自噬的細(xì)胞胞漿中首先出現(xiàn)大量膜型結(jié)構(gòu)稱為前自噬體或前自噬泡(pre－autophagosomal structure)，前自噬體進(jìn)而形成孤立膜結(jié)構(gòu)(isolation membrane)，進(jìn)一步延伸包裹細(xì)胞胞質(zhì)及變性壞死細(xì)胞器，形成雙層膜結(jié)構(gòu)的空泡結(jié)構(gòu)，即自噬體或自噬空泡(autophagosome)。自噬體再通過與溶酶體(lysosome)相融合，形成自噬溶酶體(autophagolysosome)，在此過程中，溶酶體中的水解酶水解進(jìn)入溶酶體腔的自噬體內(nèi)膜及其包裹物質(zhì)，最終自噬溶酶體破裂，分解后釋放的物質(zhì)成分得以降解及循環(huán)再利用，見圖1[1]。

1.2 程序性細(xì)胞死亡 程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，清除損傷或病變細(xì)胞等的重要機(jī)制，主要由基因控制，是細(xì)胞自主的有序性的死亡。程序性細(xì)胞死亡主要有2種，第1種是I型程序性細(xì)胞死亡即凋亡，其典型特征為細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)聚集、核片段化、細(xì)胞質(zhì)致密化、最終細(xì)胞片段化形成許多凋亡小體，被其它細(xì)胞吞入;第2種則是II型程序性細(xì)胞死亡，也稱為自噬性程序性細(xì)胞死亡，其典型特征為形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或細(xì)胞器包裹其中，最終與溶酶體相結(jié)合形成自噬溶酶體，完成降解[2]。

Figure 1.The route to the formation of autophagosome.The pre－autophagosomal structure results in a sequestering membrane termed isolation membrane，and then it enwraps cytosol and organelles to form a double－ membrane vesicle，the autophagosome.Lastly，fusing with the lysosome，the autophagosome acquires hydrolytic enzymes to generate an autophagolysosome，which is an important access to degradate and recycle organelles and cytoplasm.圖1 自噬溶酶體形成途徑

以上2種細(xì)胞死亡方式均是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要方式，它們之間存在著相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。半胱氨酸蛋白酶 caspase在細(xì)胞凋亡中起重要作用，而caspase抑制物則可以誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡，同時利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)特異性抑制自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene，ATG)及beclin－1兩種基因的表達(dá)又可影響caspase抑制物誘發(fā)的自噬[3]。因此通過調(diào)節(jié)caspase這一靶點，可以調(diào)控細(xì)胞不同死亡方式的趨向?？刂瞥绦蛐约?xì)胞死亡的關(guān)鍵分子均來源于細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白激酶(death－associated protein kinase，DAPK)家族。DAPK和DAPK相關(guān)蛋白激酶－1(DAPK－related protein kinase－1，DRP－1)利用它們的激酶活性來促使細(xì)胞死亡。一般意義上，DAPK主要通過依賴caspase途徑激活凋亡[4]。但據(jù)報道，通過持續(xù)轉(zhuǎn)染活性DAPK ΔCaM 和DRP－1 Δ73至人腎 293細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，DAPK和DRP－1主要引發(fā)細(xì)胞膜出泡生長，及自噬泡的形成，而非誘發(fā)凋亡的特征性改變，這一現(xiàn)象在MCF－7乳腺癌細(xì)胞、SV80成纖維細(xì)胞也有相似的驗證結(jié)果[5]。在小鼠L929成纖維細(xì)胞中，應(yīng)用caspase非選擇性抑制劑zVAD－FMK抑制caspase的活性并不會阻止細(xì)胞死亡，這表明還存在著不依賴caspase的自噬性程序性細(xì)胞死亡[6]。在程序性細(xì)胞死亡中，自噬結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)與細(xì)胞死亡相關(guān)，但自噬并不必然導(dǎo)致細(xì)胞死亡。自噬性細(xì)胞死亡的激活和抑制均可發(fā)生于凋亡被抑制的條件下，也均可伴有自噬基因被抑制的情況。自噬不僅可能是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一個原因，也可能是先于細(xì)胞凋亡的一種保護(hù)機(jī)制。當(dāng)刺激水平較低時，自噬可以作為維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，而當(dāng)刺激超出自噬調(diào)節(jié)能力時，則會引發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。Caspase可以通過水解自噬調(diào)節(jié)因子來抑制自噬，抑制特定的caspase活性則可能誘發(fā)自噬[3，8]?？傊?，自噬與凋亡之間通過共享著一系列的調(diào)節(jié)因子而相互聯(lián)系，相互影響。

2 創(chuàng)傷性腦損傷與自噬

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)也稱腦外傷，主要由外界機(jī)械力因素造成，傷后常并發(fā)一系列病理生理及生化改變，如蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦血管痙攣、腦循環(huán)障礙、腦水腫等，上述繼發(fā)性改變與原發(fā)性改變一起造成腦的多次嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而導(dǎo)致較高的死亡率。

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，參與神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡的病理機(jī)制，主要包括線粒體損傷、激活炎癥反應(yīng)、生成氧化自由基、激活caspase等[9]。保護(hù)神經(jīng)元是腦外傷后重要的治療目標(biāo)，而治療目標(biāo)則集中于細(xì)胞死亡程序中的相應(yīng)靶點。除了直接機(jī)械性損傷引發(fā)的細(xì)胞死亡外，細(xì)胞凋亡與自噬性細(xì)胞死亡均占有相當(dāng)比例，而自噬對于受損細(xì)胞既存在保護(hù)作用也可加劇細(xì)胞損傷，主要取決于自噬在損傷后所處的作用傾向及階段。自噬參與創(chuàng)傷性腦損傷后細(xì)胞生存死亡機(jī)制的調(diào)節(jié)，因此，在研究腦外傷后神經(jīng)損傷和修復(fù)中有重要意義[10]。

已知的一些文獻(xiàn)，已經(jīng)從不同角度證實創(chuàng)傷性腦損傷后，都會出現(xiàn)不同程度的自噬增加現(xiàn)象。而這種現(xiàn)象的判定，主要可以依據(jù)以下幾個標(biāo)志物。

2.1 Beclin－1 Beclin－1是酵母 Apg96/Vps30基因的同源表達(dá)產(chǎn)物，Bcl－2的相互作用蛋白，可與3型磷脂酰肌醇3激酶[class III phosphatidylinositol(PtdIns)3－kinase，class III PI3K]形成復(fù)合物參與自噬體的形成[11]。以往對beclin－1基因敲除小鼠的胚胎干細(xì)胞研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，beclin－1－/－小鼠自噬缺陷，細(xì)胞凋亡正常，因此beclin－1是自噬的調(diào)控基因[12]。此外，其它相關(guān)研究表明，beclin－1蛋白發(fā)揮對自噬的正調(diào)節(jié)作用，需要beclin－1從beclin－1/Bcl－2中解聚并與class III PI3K結(jié)合啟動自噬相關(guān)蛋白，而beclin－1/Bcl－2的比值也作為反映調(diào)節(jié)自噬的指標(biāo)[13]。所以，可以通過免疫印跡蛋白電泳(western blotting)檢測其在特定組織中的表達(dá)水平，從而對待測組織中細(xì)胞的自噬活性進(jìn)行監(jiān)測并判斷其水平。Diskin等[14]通過對閉合性頭部損傷小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在受損位置附近的神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞中都會出現(xiàn)beclin－1蛋白表達(dá)上調(diào)，此外，相當(dāng)一部分beclin－1過度表達(dá)的神經(jīng)元細(xì)胞在TUNEL染色中表現(xiàn)出核TUNEL陽性，表明這些細(xì)胞正經(jīng)歷某種程度的自噬。

2.2 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)LC3是酵母Atg8的同源類似物，存在于大多數(shù)的哺乳動物真核細(xì)胞中，是自噬體形成及胞漿到空泡靶向途徑(cytosol to vacuole targeting pathway，CVT)的必需蛋白[15，16]。LC3 位于前自噬泡和自噬泡膜表面，通常作為細(xì)胞自噬泡膜的標(biāo)記物。LC3－II是LC3羧基末端加工修飾后的產(chǎn)物，通常由LC3－I轉(zhuǎn)變而來。LC3－II可共價結(jié)合在磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl－ethanolamine，PE)的羧基端，且牢固地結(jié)合在自噬體膜上，其量正相關(guān)于自噬體的量現(xiàn)在廣泛用于檢測哺乳動物細(xì)胞中自噬活性[17]。

據(jù)報道，可控性腦皮質(zhì)外傷小鼠模型的研究中，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生后2－48 h，單側(cè)損傷部位附近的皮質(zhì)與海馬中可以出現(xiàn)自噬體空泡，片層小體和次級溶酶體，此外，他們還證實，外傷后損傷側(cè)鼠腦LC3－II蛋白的量，相對于未損傷側(cè)增加近1倍[18]。另外，其他研究者在大鼠模型實驗中也得到相似的結(jié)果，對比陰性對照組，損傷組鼠腦中LC3－II相對量增加了100% －200%[19，20]。且相關(guān)研究報道LC3的免疫反應(yīng)性在大鼠腦外傷后成倍增加，約在8 d 時達(dá)到頂峰[21]。

此外，還有研究探討了創(chuàng)傷性腦損傷后自噬發(fā)生的發(fā)育差異和性別差異，通過利用模擬1－4歲兒童腦代謝、神經(jīng)發(fā)育及突觸形成的年幼大鼠模型(生后17 d大鼠)，Smith等[22]證實 LC3－II在創(chuàng)傷后24和48 h幼年大鼠中也存在表達(dá)增加，即創(chuàng)傷引發(fā)的自噬并不局限于成熟的哺乳動物大腦，發(fā)育差異并不存在;但是，雄性大鼠中LC3－II的表達(dá)明顯高于雌性，即存在性別差異。

綜上所述，不同的動物模型都證實在創(chuàng)傷性腦損傷后自噬增加，也有相關(guān)報道指出人腦外傷后也會出現(xiàn)這種現(xiàn)象[23]。但自噬在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用還存在爭議，一方面，自噬可以通過清除損傷蛋白及細(xì)胞器，減少線粒體能量消耗等有利于組織修復(fù)，另一方面，自噬也可以表現(xiàn)出一些不良效應(yīng)，如損傷、減少功能性大分子和細(xì)胞器，加重細(xì)胞應(yīng)激等。

3 創(chuàng)傷性腦損傷后自噬的保護(hù)或損傷作用

3.1 保護(hù)作用 很多機(jī)制都參與自噬的調(diào)節(jié)，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR，一種絲/蘇氨基酸激酶)及3型PI3K就是兩條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(圖2)[24]。如圖所示，胞膜上的胰島素受體與1型PI3K依次激活后，生成相應(yīng)磷脂酰肌醇產(chǎn)物3，4－二磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3，4)P2]和 3，4，5 － 三磷酸磷脂酰肌醇[PtdIns(3，4，5)P3]，進(jìn)而活化 Akt/PKB及其激活物PDK－1。繼而通過Akt途徑與氨基酸一起激活mTOR，mTOR則可以拮抗自噬相關(guān)基因產(chǎn)物(Atg)誘導(dǎo)自噬的作用。此外，3型PI3K與beclin－1共同形成3型 PI3K復(fù)合體，生成PtdIns(3)P，進(jìn)而促使自噬的發(fā)生。雷帕霉素(rapamycin)作用于mTOR，而渥曼青霉素(wortmannin)、3－甲基腺嘌呤(3－methyladenine，3－MA)抑制3型 PI3K，均可抑制自噬的發(fā)生，這些靶點都是已知的調(diào)控自噬重要途徑，也是自噬神經(jīng)保護(hù)作用的重要研究方向。

雷帕霉素是一種已知的免疫抑制藥物，具有抗炎作用，并且可以抑制細(xì)胞增殖[25]。在自噬相關(guān)研究中，雷帕霉素被用于阻斷哺乳動物mTOR進(jìn)而解抑制并活化3型PI3K，最終引發(fā)自噬增加。Erlich等[26]在小鼠腦創(chuàng)傷CHI模型中，于損傷4 h后腹腔注射雷帕霉素(0.5和1.0 mg/kg)，發(fā)現(xiàn)其可以明顯改善小鼠損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。試驗中也發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制p70S6K90磷酸化，進(jìn)而解除TOR p70S6激酶通路對自噬的抑制，誘導(dǎo)自噬，并觀察到其可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活化，抑制損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)及膠質(zhì)增生，增加損傷部位幸存神經(jīng)元的數(shù)量[26]。此外，研究者通過利用 Western blotting發(fā)現(xiàn)，在雷帕霉素治療的損傷小鼠模型中，損傷小鼠會出現(xiàn)beclin－1表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而證實自噬增加，結(jié)合以上試驗結(jié)果，可以間接推斷自噬在創(chuàng)傷性腦損傷后的保護(hù)作用。

Figure 2.Schematic model of autophagic regulation.By stimulating of the class I PtdIns 3－kinase at the plasma membrane through the insulin receptor，PtdIns(3，4)P2 and PtdIns(3，4，5)P3 are produced，which allow binding and activation of Akt/PKB and its activator PDK － 1.With amino acids，Akt/PKB activates mTOR，which may be analogous to Atg1 or other ATG gene products and then inhibit autophagy.A class III PtdIns 3－kinase complex，which includes beclin 1/Atg6，generates PtdIns(3)P to cause autophagosome formation.Rapamycin can inhibit mTOR causing the induction of autophagy.In addition，wortmannin and 3－MA inhibit the class III PtdIns 3－kinase to inhibit autophagy.PDK －1:pyruvate dehydrogenase kinase－1;mTOR:mammalian target of rapamycin;Akt/PKB:Akt/protein kinase B;PtdIns:phosphatidylinositol;Atg:autophagy－specific gene;3－MA:3－methyladenine.圖2 自噬主要信號調(diào)控途徑

哺乳動物細(xì)胞處于營養(yǎng)物質(zhì)豐富環(huán)境中時，胰島素受體和氨基酸激活的mTOR及3型PI3K通路可顯著抑制細(xì)胞自噬，而禁食在以往的研究中被認(rèn)為可以弱化這種抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬增加[27]。雖然對于禁食引發(fā)自噬增加的時限仍存在爭議，但一些研究利用其這一效應(yīng)為自噬在創(chuàng)傷性腦損傷后潛在保護(hù)作用，提供了一些支持證據(jù)[28]。Davis等[29]通過對可控性腦皮質(zhì)外傷模型大鼠采取禁食24 h后，發(fā)現(xiàn)禁食可以改善腦組織損傷，并提高損傷后大鼠在莫瑞斯水迷宮試驗(Morris water maze，一種空間記憶能力測試)中的表現(xiàn)，盡管其機(jī)制中未涉及自噬在其中的作用，但考慮到前文提及禁食可以弱化mTOR及3型PI3K通路激活對細(xì)胞自噬的抑制作用，我們間接推斷禁食可能可以通過增加自噬，減少腦組織損傷細(xì)胞，從而在腦外傷后發(fā)揮一定的保護(hù)作用。這一機(jī)制有待進(jìn)一步實驗證實。

3.2 損傷作用 與前述研究結(jié)果矛盾的實驗證據(jù)表明，自噬在創(chuàng)傷性腦損傷后表現(xiàn)出一種損傷作用，而非保護(hù)作用[30]。據(jù)報道，氧化應(yīng)激及氧自由基均可誘發(fā)自噬，因此抗氧化劑可以影響自噬作用[18，31]。半胱氨酸供體γ－谷胱甘肽乙酯(γ－glutamylcysteinyl ethyl ester，GCEE，一種抗氧化劑)用于腹腔注射可控性腦皮質(zhì)外傷小鼠模型后，發(fā)現(xiàn)小鼠受損部位腦皮質(zhì)組織中LC3II的表達(dá)減少，進(jìn)而證實組織中自噬減少，同時損傷小鼠在給藥后在莫瑞斯水迷宮試驗中的表現(xiàn)提高，這與上述自噬改善小鼠表現(xiàn)的結(jié)果相矛盾[18]。另外，還發(fā)現(xiàn)GCEE可以減少損傷小鼠受損半球海馬CA1和CA3區(qū)域神經(jīng)元的死亡，減輕腦組織丟失[18]。盡管仍需要考慮其它因素的干擾，但仍可根據(jù)以上結(jié)果推斷，自噬性神經(jīng)退化作用是小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡及腦組織丟失的重要原因，并進(jìn)一步顯示了自噬可能的損傷作用。

3.3 應(yīng)用展望 基于自噬在創(chuàng)傷性腦損傷中不同作用，根據(jù)自噬啟動與延續(xù)時間，治療的靶點也不同。免疫抑制劑雷帕霉素和抗躁狂藥鋰鹽可以分別作用于mTOR和肌醇單磷酸酶(inositol monophosphatase，IMPase)誘導(dǎo)自噬激活，從而通過自噬的正性作用，清除損傷蛋白與細(xì)胞器，減輕組織損傷[26]。而3－MA等則是通過抑制自噬性細(xì)胞死亡而發(fā)揮保護(hù)作用。以上幾種藥物均已臨床上應(yīng)用于其它疾病，若應(yīng)用于創(chuàng)傷性腦損傷的治療，則需確定創(chuàng)傷后不同時點自噬的具體作用傾向，再給予相應(yīng)藥物，以期獲得合理的治療效果。此外，藥物應(yīng)用于錯誤時機(jī)，也可能造成相反效應(yīng)，如不當(dāng)?shù)淖允杉せ羁赡軙?dǎo)致神經(jīng)元死亡，加重腦損傷。因此，對于自噬在不同時點的具體作用，仍需進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，各種研究證據(jù)表明在創(chuàng)傷性腦損傷后的受損腦組織中自噬增加，其對于損傷組織的作用仍存在爭議，結(jié)果大多仍屬于推定，缺乏直接證據(jù)，需要對其作用的準(zhǔn)確機(jī)制及調(diào)控途徑進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而明確自噬對受損腦組織的作用，為改善創(chuàng)傷性腦損傷病人的預(yù)后提供新的治療靶點。

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