NCA增加心肌收縮力的作用研究*

鐘 鑫， 賈洪麗， 侯俊青， 王育文， 時 颯， 李志韜

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)1病理生理教研室，黑龍江生物醫(yī)藥工程重點實驗室，2附屬第二醫(yī)院檢驗科，黑龍江哈爾濱150081)

NO影響心臟功能的作用已經(jīng)被廣泛報導(dǎo)，而作為它的去電子形式 －硝酰基(nitroxyl，HNO)對心臟功能的影響最近才被關(guān)注[1]。HNO在正常及衰竭[2，3]心臟都起到正性、非負荷依賴性肌力作用。研究表明HNO具備β受體激動劑的作用且不被β受體阻滯劑所阻斷。NO或硝酸鹽所產(chǎn)生的HNO在體內(nèi)對心血管活動作用非常明顯，因為后者在靜息心肌上只表現(xiàn)適度的正性肌力效應(yīng)[4]。與NO不同的是，如果細胞內(nèi)還原當(dāng)量的含量增加，HNO活性則明顯減低甚至消失[10]，該結(jié)果支持了HNO基本化學(xué)作用中以硫基為靶點的論斷[1]。

HNO生理作用表明其可以作為心衰的一種新型治療手段，同時增加了對心衰細胞和分子機制進一步的理解。HNO能夠刺激鈣離子從心肌及骨骼肌[5]的ryanodine受體 (RyR)釋放。在心肌細胞，最初研究資料表明此作用是不依賴cGMP及cAMP的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式[6]。除對鈣離子影響之外，HNO也可能與原肌球蛋白(tropomyosin，Tm)相互作用改變其收縮反應(yīng)。NO及其相關(guān)物質(zhì)如過亞硝酸鹽[7，8]則以cGMP依賴的方式減低肌原纖維對鈣離子的反應(yīng)能力。HNO在可調(diào)節(jié)性細肌絲和/或肌原纖維蛋白上可能作用于巰基靶點改變張力的產(chǎn)生。

以往研究使用HNO供體，Angeli’s salt(AS)。AS不是純HNO供體，而是同時釋放HNO和亞硝酸鹽[9]。亞硝酸鹽不刺激心肌產(chǎn)生收縮性反應(yīng)，在體內(nèi)主要導(dǎo)致血管舒張[3]。乙酸1－亞硝基環(huán)已酯(1－nitrosocyclohexyl acetate，NCA)不釋放亞硝酸鹽，是較純的HNO供體，其發(fā)展將對HNO生化作用及機制進行更有效的分析。目前的研究用來檢測NCA是否改變了肌原纖維對鈣離子的反應(yīng)能力。應(yīng)用完整的大鼠梳狀肌，觀察了HNO供體NCA對心臟興奮 －收縮偶聯(lián)的影響。我們發(fā)現(xiàn)NCA以劑量依賴的方式增加[Ca2+]i水平及心肌收縮力，同時增強肌原纖維對鈣離子的反應(yīng)性。NCA效應(yīng)被還原劑二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DTT)阻斷，支持硫醇鹽在此過程中發(fā)揮靶點角色的論斷。

材料和方法

1 動物及試劑

20只Sprague－Dawley大鼠，體重250－300g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;NCA由美國約翰霍普金斯大學(xué)高衛(wèi)東實驗室贈予。

2 梳狀肌制備

大鼠腹腔注射戊巴比妥 (100 mg/kg)麻醉，沿胸骨中部切開暴露心臟，迅速摘除心臟并將其放置在標(biāo)本盤中。室溫下(21－22℃)進行主動脈插管并用含有95%O2及5%CO2的解剖Krebs－Henseleit(K－H)液逆行灌流。K－H液組成(mmol/L):NaCl 120，NaHCO320，KCl 5，MgCl21.2，葡萄糖10，CaCl20.5 及2，3 － 丁二酮 20，pH 7.35 － 7.45。取自于右心室的梳狀肌置于張力換能器和刺激電極之間。然后，對其進行K－H液表面灌流(10 mL/min)，同時給予頻率為0.5 Hz的刺激。解剖顯微鏡下 (×40，分辨率10 μm)標(biāo)準(zhǔn)刻度線測量梳狀肌的尺寸。

3 張力及肌小節(jié)長度的測定

應(yīng)用張力換能系統(tǒng) (KG7，Scientific Instruments GmbH)對收縮力進行測量并以mN/mm2橫斷面積來表示。肌小節(jié)長度通過激光衍射法[10]進行測量。通過網(wǎng)狀二極管線陣系統(tǒng) (RC0100－RG512，EG＆G Reticon)檢測肌肉中部衍射光線。衍射的初級光強度被整合，應(yīng)用定制的肌小節(jié)長度檢測系統(tǒng)(University of Calgary)測出光強度分布中值，從而決定肌小節(jié)長度。實驗過程中靜息肌小節(jié)長度設(shè)定為2.2 －2.3 μm。

4 [Ca2+]i測定

應(yīng)用Fura－2游離酸的形式對[Ca2+]i進行測定[11]。Fura－2鉀鹽采用離子透入法用玻璃電極顯微注射入一個細胞，經(jīng)縫隙連接擴散至整個肌組織。微電極頂端 (直徑0.2 μm)充滿Fura－2鹽溶液 (1 mmol/L)，其余部分用150 mmol/L KCl充滿。在靜息肌組織中成功用微電極刺入表面細胞后，不間斷傳送5－10 nA超極化電流15 min。在一些肌組織不同部位可以重復(fù)注射 (最多3－4次)，每個部位注射持續(xù)時間 ＜10 min以達到較好的信噪比。如前所述:此負載不影響張力發(fā)展[11]。Fura－2回波熒光在380 nm及340 nm激發(fā)并測定，在510 nm用光電倍增管 (R1527，Hamamatsu)收集熒光并進行數(shù)字化分析。通過下列方程得出[Ca2+]i(減去自發(fā)熒光):[Ca2+]i=K’d(R － Rmin)/(Rmax－R)。R是實測的熒光率 (340/380)，K’d是表觀解離常數(shù)，Rmax是[Ca2+]i飽和時340 nm/380 nm 比率，Rmin是[Ca2+]i為 0時 340 nm/380 nm 比率。K’d，Rmax及 Rmin的值由前述體內(nèi)校準(zhǔn)法[11]所決定。

5 梳狀肌穩(wěn)態(tài)激活作用及去肌膜心肌組織收縮力的測定

Ryanodine(1.0 μmol/L)應(yīng)用于穩(wěn)態(tài)激活作用。暴露于 ryanodine 15 min后，在多種[Ca2+]o(0.5－20.0 mmol/L)下以10 Hz頻率刺激肌組織，不同水平的強直被暫時(4－8 s)誘導(dǎo)出現(xiàn)。1%Txiton X－100應(yīng)用于梳狀肌去肌膜反應(yīng)。心肌組織被1%Txiton X －100作用10 min后，膜性結(jié)構(gòu)破壞，僅保留蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)進行實驗。實驗過程均在室溫下(20－22℃)進行。

6 Western blotting檢測

取右心室心肌組織蛋白提取液，室溫下SDSPAGE電泳，4℃轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，常規(guī)洗脫，相應(yīng)Ⅰ抗 (1∶3 000稀釋)和Ⅱ抗 (1∶2 000稀釋)孵育，反復(fù)洗膜后堿性磷酸酶試劑顯色。Quality圖像分析系統(tǒng)對免疫印記結(jié)果進行定量分析。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 NCA增加完整大鼠梳狀肌收縮力的作用強于增加[Ca2+]i效應(yīng)

圖1可見，給予NCA出現(xiàn)典型的收縮力及相應(yīng)的[Ca2+]i變化。收縮力的增強不是由于K －H緩沖液的堿化所致，因為檢測緩沖液pH不發(fā)生變化。圖1顯示收縮力增強而舒張力變化不明顯，同時，收縮期[Ca2+]i增加而舒張期[Ca2+]i不變。兩者均增加的情況下，收縮期力的增加比收縮期[Ca2+]i變化更為顯著，該結(jié)果支持NCA增加肌原纖維對鈣離子的敏感性。

Figure 1.Changes of force(B，D)and[Ca2+]itransient(A，C)treated with various concentrations of NCA.A，B:time－course changes;C，D:changes in systolic and diastolic phases.Temperature:22 ℃;sarcomere length=2.2 μm;[Ca2+]o=0.5 mmol/L±s.n=8－9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs before drug.圖1 收縮力與[Ca2+]i的變化

不同頻率條件下 (0.5－3.0 Hz)同對照組相比，NCA處理組始終表現(xiàn)明顯更高的收縮力(P＜0.01)，而[Ca2+]i變化則無明顯差別 (P ＞0.05)，見圖2。

Figure 2.Changes of force(A)and[Ca2+]itransient(B)at different frequencies(0.5－3.0 Hz)before and after NCA treatment.Experimental temperature was 22℃.Sarcomere length was set at 2.2 μm and[Ca2+]o=0.5 mmol/L.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 收縮力－頻率相互關(guān)系

2 NCA增加完整大鼠梳狀肌對鈣離子的反應(yīng)性

對照組最大鈣離子活化張力為(90.0±4.2)mN/mm2，達到 50% 活性需要[Ca2+]i(Ca50)為(0.57±0.03)μmol/L。給予NCA后，心肌收縮力峰值增加[(124.0±15.0)mN/mm2，P ＜ 0.05 vs control]，達到 50% 活性需要[Ca2+]i明顯降低[(0.39±0.01)μmol/L;P ＜ 0.01 vs control]。給予NCA的心肌組織，其希爾系數(shù)沒有受到影響 (3.94±0.18 vs 4.92 ±0.84，P＞0.05)。由此可見，NCA/HNO可以增強最大鈣離子活化張力。給予NCA后，不同細胞外鈣濃度 (0.01 －100 μmol/L)去肌膜心肌組織心肌收縮力峰值增加，Ca50降低[NCA － group，Ca50=0.3 μmol/L，P ＜ 0.01 vs control(1.35 μmol/L);Fmax=(90.1 ± 1.6)mN/mm2，P ＜0.05 vs control[(85.2 ± 1.2)mN/mm2]，見圖3。

3 NCA誘導(dǎo)下張力發(fā)展對細胞內(nèi)還原當(dāng)量的敏感性

Figure 3.Steady－state force－Ca2+relations in intact(A)and skinned(B)muscles.±s.n=9(A)or n=6(B).*P ＜0.05 vs control.圖3 NCA增加心肌纖維對Ca2+反應(yīng)性

DTT對于基本的收縮力無效;然而，它能阻斷NCA(20 μmol/L)誘導(dǎo)的Ca2+敏感作用。DTT在5－10 min內(nèi)逆轉(zhuǎn)NCA增加收縮力作用，見圖4。在無DTT存在條件下，收縮力將保持其興奮性長達20 min以上。由此可見，DTT可以阻止并逆轉(zhuǎn)NCA對收縮力的作用效果。

Figure 4.DTT(5 mmol/L)not only prevented but also reversed the effect of NCA on force development.±s.n=6.*P＜ 0.05 vs NCA.圖4 DTT影響NCA增加收縮力的作用

4 NCA增加心肌收縮力通過肌原纖維蛋白質(zhì)巰基翻譯后修飾來實現(xiàn)

非還原條件下 (無DTT)NCA/HNO使肌原纖維(如Tm)分子發(fā)生交聯(lián)，而還原條件則交聯(lián)條帶消失，見圖5。

Figure 5.Western blotting of cardiac non－ reducing(A)and reducing(B)tropomyosin(39 kD).A cross－ linking band(78 kD)in tropomyosin was seen under non－ reducing condition.There was no change in reducing tropomysim.M:marker.10 μg，20 μg and 30 μg:the total protein loading quantity.圖5 NCA在還原條件下對Tm的翻譯后修飾作用

討 論

本實驗首次研究了NCA提供的HNO在分離、完整的心肌組織上產(chǎn)生一種直接劑量依賴性的正性變力作用。該作用不僅包括增加了心肌收縮力和[Ca2+]i瞬時電流峰值，而且由于最大[Ca2+]i升高活化了張力，使得這些變化在敏感性上的增長是不對稱的。此反應(yīng)與NO作用效果不同，可被還原劑DTT所阻斷，同時具備較強的氧化還原反應(yīng)敏感性。

NO與HNO僅相差1個電子。然而，HNO被認為能應(yīng)用巰基化合物和高鐵蛋白進行加成反應(yīng)[12]而NO則不能。NO的靶點首先是非氧合細胞溶質(zhì)內(nèi)可溶解性二價鐵鳥苷酸環(huán)化酶，而HNO生物活性的主要靶點則是巰基蛋白質(zhì)或巰基肽[1]。盡管NO cGMP非依賴性收縮效應(yīng)已經(jīng)被證實，但大部分NO對心臟的作用仍與cGMP/PKG激活作用相關(guān)。一項重要的證據(jù)支持cGMP/PKG的激活是NO(及其被氧化的同源物質(zhì))對心臟進行調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，借此減低了肌原纖維對Ca2+脫敏后的收縮性[7]。這樣的脫敏作用被認為對加速心肌舒張具有重要意義。該作用可因PKG藥物阻斷或遺傳缺失，或心肌鈣蛋白I在Ser23/24位點磷酸化[13]而被抑制?；钚缘愇镔|(zhì)過亞硝酸鹽也能降低肌原纖維對鈣離子的反應(yīng)性，導(dǎo)致心臟抑制效應(yīng)，部分效應(yīng)是由 PKG介導(dǎo)的[8]。

由NCA提供的HNO反應(yīng)則完全不同，這可能由于其與鳥苷酸環(huán)化酶或作為收縮機制的主要靶點半胱氨酸殘基相互作用。研究表明HNO對選取的硫醇鹽(－S·)發(fā)生反應(yīng)，對巰基化合物亞群(－SH)也有高反應(yīng)性[1]，這些反應(yīng)都證實了HNO具有選擇性和作用可逆性。目前和以往資料表明，收縮作用可迅速用DTT逆轉(zhuǎn)。在分離的家兔心臟肌漿網(wǎng)囊泡[5]或大鼠心肌細胞上[8]研究發(fā)現(xiàn)HNO誘導(dǎo)的肌漿網(wǎng)鈣離子的釋放也可被DTT完全逆轉(zhuǎn)。最近在酵母的一項研究中也顯示了HNO選擇性，不改變細胞內(nèi)巰基化合物前提下，HNO在其活化位點硫醇鹽殘基內(nèi)具有特異性的靶點磷酸甘油醛脫氫酶[14]。我們假設(shè)NCA/HNO可以在肌原纖維和/或調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)的半胱氨酸“靶點”上誘發(fā)相似的具有選擇性的化學(xué)修飾，Western blotting證實NCA在非還原條件下使肌原纖維的Tm分子發(fā)生交聯(lián)，該作用可能促進橫橋轉(zhuǎn)換率發(fā)生變化，進而增加收縮張力的產(chǎn)生。進一步的研究旨在明確這些變化的分子性質(zhì)和位點。

HNO增加最大Ca2+活化張力機制至今尚不清楚。然而，研究表明僅最大Ca2+活化張力的增加即可導(dǎo)致橫橋的變化。張力發(fā)展依賴于相關(guān)橫橋的數(shù)目及其動力學(xué)特征。橫橋轉(zhuǎn)換率能明顯影響張力 －pCa之間的相互關(guān)系，從而增加與Ca2+活化張力相關(guān)性的比率。HNO誘導(dǎo)的橫橋循環(huán)性的改變是引起改變收縮性的唯一途徑，這與在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)內(nèi)進行變化來調(diào)節(jié)收縮性的機制密切相關(guān)。

我們的研究也證實了在完整心肌組織內(nèi)[Ca2+]i增加是由NCA誘導(dǎo)的。盡管[Ca2+]i的增加與肌原纖維致敏作用的相關(guān)性已經(jīng)被證實，但這種增加可能是在較高NCA劑量條件下成為增強心肌收縮力的基礎(chǔ)。在分離的小鼠肌細胞實驗研究中，HNO可以增加鈣離子的吸收及其從肌漿網(wǎng)的釋放，適當(dāng)增加瞬時電流而不出現(xiàn)舒張期鈣離子的逆轉(zhuǎn)[6]。這可以對目前研究中所觀察的[Ca2+]i的變化進行解釋。這些機制與致敏效應(yīng)一起表明HNO對心臟肌原纖維及肌漿網(wǎng)具有新奇的效應(yīng)，可以在缺乏能量供應(yīng)的條件下增加心肌潛在的收縮能力。

總言之，NCA提供的HNO能增強大鼠心肌組織收縮力和細胞內(nèi)鈣瞬變，且前者變化幅度大于后者，這種作用部分由于肌原纖維對鈣離子敏感性的增加所致。該作用對于還原性環(huán)境較敏感。該作用的主要分子靶點可能是Tm半胱氨酸的巰基蛋白質(zhì)。進一步研究需要證實NCA對心力衰竭動物模型心肌收縮力的作用效果，為實現(xiàn)NCA/HNO的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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