高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈重塑的觀測(cè)及相關(guān)蛋白表達(dá)探討*

孫敬昌， 齊冬梅， 李運(yùn)倫

(山東中醫(yī)藥大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2科技處，山東濟(jì)南250355;3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東濟(jì)南250011)

血管重塑是血管對(duì)血液動(dòng)力學(xué)或體液因素等的改變而發(fā)生的適應(yīng)性變化，它構(gòu)成了高血壓并發(fā)癥及循環(huán)紊亂的病理生理基礎(chǔ)，主要病理表現(xiàn)為血管壁細(xì)胞成分增殖和凋亡的失衡以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。目前對(duì)高血壓血管重塑的研究多集中在外周血管，對(duì)大網(wǎng)膜小動(dòng)脈的重塑狀況研究較少。本文旨在評(píng)價(jià)高血壓患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈重塑以及相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況，力求通過(guò)多窗口、全方位識(shí)別高血壓血管病變，從而為防治高血壓心腦血管事件提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對(duì)象 以高血壓病患者和非高血壓病對(duì)照者大網(wǎng)膜中的小動(dòng)脈為研究標(biāo)本。標(biāo)本采集方法:取外科急腹癥手術(shù)切除、廢棄的大網(wǎng)膜組織，取其中的小動(dòng)脈，固定備用。

1.2 主要試劑 即用型SABC免疫組化檢測(cè)試劑盒、親和純化Bax鼠單抗IgG和親和純化Bcl-2鼠單抗IgG、親和純化c-Myc鼠單抗IgG和親和純化c-Fos兔多抗IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;MMP-9鼠單抗IgG和TIMP-2鼠單抗IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物制品有限公司;生物素化山羊抗兔IgG和DAB顯色劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 分組 高血壓病患者組和非高血壓病對(duì)照者組。高血壓病組患者符合WHO/ISH的高血壓診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，不伴有冠心病、糖尿病、高脂血癥等，長(zhǎng)期或間斷服用降壓藥物。

2.2 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

①血壓測(cè)量 參照2003年《中國(guó)高血壓防治指南》的測(cè)量方法。

②血液流變學(xué)參數(shù)檢測(cè) 采用錐板式穩(wěn)態(tài)測(cè)量方法，觀察全血黏度低切(whole blood viscosity low cut，WBV-LC)、全血黏度中切(whole blood viscosity cut，WBV-MC)、全血黏度高切(whole blood viscosity high cut，WBV-HC)、毛細(xì)管血漿黏度(capillary plasma viscosity，CPV)、紅細(xì)胞壓積 (hematocrit，HCT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、全血還原黏度低切(whole blood reduction viscosity low cut，WBRV-LC)、全血還原黏度中切(whole blood reduction viscosity middle cut，WBRV-MC)、全血還原黏度高切(whole blood reduction viscosity high cut，WBRV-HC)和纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation product，F(xiàn)DP)等參數(shù)。

③大網(wǎng)膜小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)檢測(cè) 將摘取的大網(wǎng)膜的小動(dòng)脈用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，將血管橫切成厚度7 μm的薄片，HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察，并用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)量、計(jì)算大網(wǎng)膜小動(dòng)脈中膜厚度與管腔直徑的比值。

④大網(wǎng)膜小動(dòng)脈Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9、TIMP-2蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)SABC法，結(jié)果以HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，每張切片任選5個(gè)視野測(cè)量積分吸光度，取均值作為該樣本的蛋白相對(duì)表達(dá)量。⑤大網(wǎng)膜小動(dòng)脈膠原含量的比較 采用Masson染色法。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

結(jié) 果

1 2組血壓比較

納入研究的高血壓病患者和非高血壓病對(duì)照者各12例，分析比較高血壓病患者組和非高血壓病對(duì)照者組的血壓狀況，顯示2組的收縮壓和舒張壓均有顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明納入研究的對(duì)象符合設(shè)計(jì)要求，見(jiàn)表1。

表1 2組血壓比較Table 1.BP comparison between two groups(mmHg.±s.n=12)

表1 2組血壓比較Table 1.BP comparison between two groups(mmHg.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal group.

Group SBP DBP Normal 125.7±12.6 81.2±8.9 HBP 162.5 ±14.0＊＊ 97.6 ±9.3＊＊

2 2組血液流變學(xué)參數(shù)比較

高血壓病患者組血液流變學(xué)參數(shù)較非高血壓病對(duì)照者組有不同程度升高，尤以纖維蛋白原升高明顯，表明高血壓病患者組存在血液流變學(xué)異常，血液處于濃、黏、聚、凝狀態(tài)，見(jiàn)表2。

表2 2組血液流變學(xué)比較Table 2.Comparison of hemorheology between two groups(±s.n=12)

表2 2組血液流變學(xué)比較Table 2.Comparison of hemorheology between two groups(±s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group WBV-LC WBV-MC WBV-HC CPV HCT(%) ESR(mm/h) WBRV-LC WBRV-MC WBRV-HC FDP(g/L)Normal 8.97±1.89 5.83±2.01 5.25±1.17 1.34±0.41 44.34±5.47 15.17±6.64 16.48±4.03 10.91±3.17 8.32±2.17 2.16±0.45 HBP 10.49±4.70 6.43±1.37 5.95±2.10 1.39±0.36 43.20±7.87 15.90±7.95 18.90±6.36 13.17±4.06 9.11±2.59 4.97±0.87*

3 2組血管形態(tài)學(xué)比較

3.1 2組病理學(xué)比較 與非高血壓病對(duì)照者相比，高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈管壁有不同程度增厚，其中膜平滑肌細(xì)胞肥大、增生，彈力纖維排列紊亂，膠原纖維增生。可見(jiàn)高血壓病患者大網(wǎng)膜組織的小動(dòng)脈存在血管損害和纖維組織重塑，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Comparison of pathological changes(HE staining，×100).A:normal group;B:HBP group.圖1 2組病理比較

3.2 2組體視學(xué)比較 高血壓病患者組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈中膜厚度/管腔直徑的比值較非高血壓對(duì)照者顯著增大(P＜0.05)，提示高血壓病患者大網(wǎng)膜的小動(dòng)脈存在血管重塑，見(jiàn)表3。

4 2 組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP－9和TIMP－2蛋白表達(dá)的比較

高血壓病患者組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9 和 TIMP-2 積分吸光度均較非高血壓病對(duì)照者顯著升高(P＜0.05)，表明在高血壓病患者大網(wǎng)膜的小動(dòng)脈 Bcl-2、Bax、c-Myc、c-Fos、MMP-9和 TIMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)表4、圖2。

表4 2組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9和 TIMP －2表達(dá)的比較Table 4.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in omental arterioles between the two groups(±s.n=12)

表4 2組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9和 TIMP －2表達(dá)的比較Table 4.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in omental arterioles between the two groups(±s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group Bcl-2 Bax c-Myc c-Fos MMP-9 TIMP-2 Normal 24.60±7.32 18.50±5.71 14.14±5.15 74.40±7.97 289.00±7.55 58.80±7.98 HBP 51.32±8.33* 30.87±6.13* 48.31±9.46* 144.40±10.86* 387.80±12.32*159.50±12.36*

Figure 2.Comparison of Bcl-2，Bax，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression(immunohistochemical staining，×400).A1-A6:Bcl-2，Bax-2，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in normal group，respectively;B1-B6:Bcl-2，Bax-2，c-Myc，c-Fos，MMP-9 and TIMP-2 protein expression in HBP group，respectively.圖2 2組 Bcl－2、Bax、c－Myc、c－Fos、MMP －9及 TIMP －2蛋白表達(dá)比較

5 各組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈膠原含量的比較

非高血壓病對(duì)照者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈壁存在膠原纖維表達(dá)，而高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈壁膠原纖維增多，說(shuō)明在高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈壁存在較強(qiáng)的膠原纖維沉積現(xiàn)象，見(jiàn)圖3。

表3 2組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 3.Comparison of mid layer thickness/luminal diameter ratio in omental arterioles between the two groups(± s.n=12)

表3 2組大網(wǎng)膜小動(dòng)脈中膜厚度/管腔直徑比值比較Table 3.Comparison of mid layer thickness/luminal diameter ratio in omental arterioles between the two groups(± s.n=12)

*P＜0.05 vs normal group.

Group Media layer thickness/luminal diameter(×10-2)Normal 7.58±0.52 HBP 13.45±0.60*

Figure 3.Comparison of arteriolar collagen content(Masson dyeing，×100，grey is collagen).A:normal group;B:HBP group.圖3 2組小動(dòng)脈膠原含量的比較

討 論

高血壓血管重塑是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，從內(nèi)皮功能障礙、動(dòng)脈粥樣斑塊形成，到最后粥樣斑塊破裂或脫落導(dǎo)致管腔完全閉塞引起急性心腦血管事件，大約需要十幾年至數(shù)十年的時(shí)間。因此，全面識(shí)別高血壓亞血管病變對(duì)于預(yù)防心腦血管事件具有重要意義[1]。病理學(xué)結(jié)合體視學(xué)觀測(cè)在血管重塑的檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用。本研究應(yīng)用病理學(xué)結(jié)合體視學(xué)觀測(cè)大網(wǎng)膜小動(dòng)脈的重塑狀況，結(jié)果顯示高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈的管壁不同程度增厚，其中膜平滑肌細(xì)胞肥大、增生，彈力纖維排列紊亂，膠原纖維增生，中膜厚度/管腔直徑的比值明顯升高，從而說(shuō)明高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈存在血管重塑現(xiàn)象。

高血壓血管重塑的發(fā)生機(jī)理復(fù)雜，有學(xué)者認(rèn)為異常血流動(dòng)力學(xué)改變參與了血管重塑的病理改變，是高血壓動(dòng)脈重塑的可能機(jī)制之一，血流速率的慢性改變引起血管口徑改變，血壓變化引起管壁厚度改變[2]。高血壓狀態(tài)下，因血管內(nèi)流體靜壓升高，血管壁張力持續(xù)增強(qiáng)，可直接刺激血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、肥大，管壁肥厚。本研究顯示高血壓患者存在血液流變學(xué)異常，血液處于濃、黏、聚、凝狀態(tài)，表明血液流變學(xué)異?？赡苁歉哐獕夯颊叽缶W(wǎng)膜小動(dòng)脈重塑的原因之一。

有研究表明，原發(fā)性高血壓與血管平滑肌細(xì)胞的增殖加速與凋亡抑制失衡有關(guān)[3]。凋亡對(duì)于除去多余的有害或衰老細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及維持組織構(gòu)型具有重要意義[4]?，F(xiàn)已明確，Bcl-2和Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的一對(duì)重要蛋白。Bcl-2蛋白能抑制多種因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡[5]，其作用機(jī)制是直接或間接阻止細(xì)胞色素C自線粒體的釋放，而后者可與三磷酸腺苷一起改變凋亡激活因子1(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)的構(gòu)型而使凋亡蛋白酶(caspase-9)激活，Bcl-2可直接與Apaf-1結(jié)合/或阻止細(xì)胞色素C釋放，抑制caspases級(jí)聯(lián)激活[6]。有研究顯示，血壓與Bcl-2濃度呈正相關(guān)，患者血清Bcl-2濃度隨血壓增高而升高，加速了血管平滑肌細(xì)胞的增生，抑制其凋亡[7]。Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白之一，能夠?qū)笲cl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用[8]，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax過(guò)表達(dá)時(shí)，形成同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2過(guò)表達(dá)時(shí)形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡[9]。原癌基因c－fos是體內(nèi)重要的編碼核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，可編碼核內(nèi)多種信息分子，對(duì)細(xì)胞分化、增殖起重要作用，它的激活被認(rèn)為是在血管損傷后VSMCs增殖的始動(dòng)因素之一[10]。c－myc是一個(gè)功能廣泛的核內(nèi)癌基因，它表達(dá)的蛋白質(zhì)為 c-Myc蛋白，c-Myc蛋白表達(dá)增高與VSMCs增殖和遷移密切相關(guān)，在一些致高血壓因素作用下，c-Myc異常表達(dá)，促進(jìn) VSMCs增殖[11]。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈Bcl-2、Bax、c-Fos和c-Myc蛋白表達(dá)上調(diào)，提示在高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈壁存在平滑肌細(xì)胞凋亡、增殖的失衡，致使血管增殖肥厚，成為血管重塑的重要病理機(jī)制之一。

細(xì)胞外基質(zhì)的代謝受基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhititor of metalloproteinases，TIMPs)調(diào)控，MMPs/TIMPs的動(dòng)態(tài)平衡維持血管的正常功能[12]。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵酶，其中MMP-9又稱(chēng)明膠酶B，主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原及層黏連蛋白、蛋白聚糖及彈性蛋白等，能降解完整的基底膜[13]。TIMPs(如 TIMP-1、-2、-3、-4)是 MMPs的抑制物，能特異性地與MMPs催化活性中心的鋅離子結(jié)合，而封閉其催化活性。本研究發(fā)現(xiàn)高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈存在MMP-9和TIMP-2高表達(dá)，且TIMP-2增高幅度較MMP-9增高幅度大，提示MMP-9和TIMP-2表達(dá)失衡可能是高血壓病患者大網(wǎng)膜小動(dòng)脈重塑的原因之一。

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