法尼醇X受體在高甘油三酯血癥大鼠腎臟的表達和定位

胡志娟 劉 冰 任路平 李 凡 孫 文 宋光耀 (河北省人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 05005)

當(dāng)今飲食結(jié)構(gòu)的變化致使果糖的攝入量逐年增加。果糖代謝導(dǎo)致甘油三酯(TG)的甘油和酰基部分明顯增多，導(dǎo)致脂質(zhì)從頭合成以及TG合成的速率明顯增強〔1〕。脂質(zhì)腎毒性學(xué)說認為，在一些情況下，循環(huán)中的脂質(zhì)可能直接損害腎小球結(jié)構(gòu)，高脂血癥在啟動腎小球損害至腎小球硬化的過程中是一個重要的加重因素〔1〕。法尼醇X受體(farnesoidreceptor，F(xiàn)XR)在肝臟、腎臟、腎上腺和小腸組織中高表達，同時還存在于脂肪組織、心臟、脾臟和血管平滑肌中〔2〕。FXR參與機體內(nèi)膽汁酸的代謝、脂代謝和糖代謝，并起著重要的調(diào)節(jié)作用〔3〕。本研究采用高果糖飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠高TG血癥，觀察腎組織脂質(zhì)的蓄積、腎臟病理形態(tài)的變化以及FXR的表達和定位，并通過膽汁酸治療進一步探討脂質(zhì)腎毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與分組 健康雄性Wistar大鼠32只(由河北醫(yī)科大學(xué)動物室提供)，體重200 g左右，隨機分成正常對照組(N組)及高果糖組(F組)，每組16只。正常對照組為普通飼料，高果糖組中果糖占熱量的34.5%。每日記大鼠進食量，每周記大鼠體重。喂養(yǎng)8 w及16 w時各處死大鼠8只，大鼠處死前一天采用代謝籠收集24 h尿標(biāo)本，處死時留取血標(biāo)本。腎臟經(jīng)生理鹽水充分灌洗后稱重，部分組織以10%甲醛固定、石蠟包埋，制成3 μm厚切片，其余組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生化測定 大鼠處死時以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各組大鼠(2 ml/100 g)，右側(cè)頸動脈取血標(biāo)本約8 ml。血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FPG)及血脂的測定在Beckman全自動生化分析儀上完成。24 h尿微量白蛋白(24 h UMA)定量采用免疫比濁法。

1.3 腎皮質(zhì)脂質(zhì)提取及TG測定 以3%戊巴比妥腹腔注射麻醉各組大鼠(2 ml/100 g)，用0.1 mmol PBS緩沖液進行左腎灌洗，灌洗速度為10 ml/min，PBS總量為50 ml，灌洗后腎臟呈灰白色，分離腎皮質(zhì)，取200 mg皮質(zhì)按Macala〔4〕等方法進行脂質(zhì)提取及定量分析。

1.4 腎組織病理檢測 經(jīng)10%甲醛固定的腎組織石蠟包埋，制成3 μm厚的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化行PAS染色。腎組織5 μm冰凍切片行油紅O脂質(zhì)染色。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測FXR的表達 10%甲醛固定、石蠟包埋的腎組織進行3 μm厚的連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，熱修復(fù)140℃、2 min;3%過氧化氫室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3;滴加兔抗FXR抗體(美國，Santa Cruz)，4℃過夜，PBS 沖洗2 min×3;再依此加入聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記的兔抗IgG工作液，37℃孵育20 min，每個步驟后均PBS沖洗，2 min×3。DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片鏡檢。PBS(磷酸鹽)緩沖液替代一抗作陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 左腎重/體重(KW/BW)、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較 與對照組比較，8 w及16 w高果糖組大鼠KW/BW、BUN、Scr、膽固醇(TC)及FPG變化無明顯差異(P＞0.05);TG、極低密度脂蛋白(VLDL)及24 h UMA在高果糖組明顯升高(P＜0.05)，且隨時間延長其水平均增加。見表1。

2.2 腎皮質(zhì)TG含量 與對照組〔8 w:(4.30±0.76)mg/g，16 w:(5.16±1.70)mg/g〕比較，高果糖組腎皮質(zhì) TG含量〔8 w:(7.21±2.20)mg/g，16 w:(7.92±3.05)mg/g〕明顯增加(P＜0.05)，且隨時間延長其水平均增加。

表1 各組大鼠左腎重/體重、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較(± s，n=8)

表1 各組大鼠左腎重/體重、腎功能、血脂、FPG及24 h UMA比較(± s，n=8)

與對照組比較:1)P＜0.05

對照組 8 w 3.11±0.27 6.46±0.50 33.75±3.28 1.50±0.210.79±0.31 0.40±0.14 5.19±0.58 20.00±6.00 16 w 3.34±0.56 6.59±1.37 41.39±6.39 1.66±0.14 1.09±0.36 0.50±0.16 5.45±0.47 45.00±24.00高果糖組 8 w 3.38±0.22 6.54±0.66 42.56±8.25 1.59±0.20 1.65±0.861)0.75±0.391) 5.84±0.56 63.00±12.001)16 w 3.63±0.41 6.69±0.85 45.57±3.67 1.82±0.65 2.13±0.871)0.97±0.401) 6.01±0.37 150.00±48.001)

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色(×200)

圖2 各組大鼠腎組織油紅O染色(×200)

圖3 各組大鼠腎組織中FXR免疫組織化學(xué)表達(×200)

2.3 腎臟病理改變 光鏡下可見(PAS染色)高果糖組大鼠腎小球系膜細胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時間延長，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見明顯病變。油紅O染色可見高果糖組腎小球及近端腎小管內(nèi)油紅O染色陽性，隨時間延長，病變加重，提示中性脂質(zhì)進行性蓄積。見圖1、圖2。

2.4 腎組織FXR的表達 FXR在正常大鼠腎臟組織中主要分布在近曲小管，高果糖組大鼠FXR在上述區(qū)域的表達顯著下調(diào)，隨病程延長，表達減弱。見圖3。

3 討論

果糖同葡萄糖相比，更能誘導(dǎo)膽固醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和肝臟脂質(zhì)從頭合成〔1〕。果糖對機體的危害有:肥胖、加速衰老、胰島素抵抗、糖尿病、糖尿病并發(fā)癥(視網(wǎng)膜病變、腎臟疾病、神經(jīng)疾病)、非酒精性脂肪肝、高甘油三酯血癥、高尿酸血癥、慢性腹瀉、腸應(yīng)激綜合征、蕁麻疹〔5〕。

腎臟疾病時常常伴有高TG血癥，研究發(fā)現(xiàn)血清TG水平與尿蛋白排泄率、腎小球濾過率的下降有顯著相關(guān)性〔6〕，提示TG以及富含TG的脂蛋白具有腎毒性作用。脂質(zhì)在腎臟沉積，在炎癥細胞浸潤、腎臟固有細胞增生和損傷、細胞外基質(zhì)積聚及泡沫細胞形成等過程中，直接或間接地導(dǎo)致腎小球硬化。

本研究中，經(jīng)過8 w高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠高TG血癥及高VLDL血癥而血糖水平無明顯升高;16 w時，大鼠的上述指標(biāo)升高更為明顯而血糖水平仍無顯著差異，提示脂代謝紊亂往往出現(xiàn)在糖代謝紊亂之前。本研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠在腎皮質(zhì)亦出現(xiàn)TG的蓄積，表現(xiàn)在腎皮質(zhì)TG含量增加以及油紅O染色可見陽性的細胞，隨時間延長，上述指標(biāo)水平升高。高果糖組大鼠在實驗8 w時出現(xiàn)尿微量白蛋白水平顯著增加，該指標(biāo)是早期腎損害較為敏感的指標(biāo)，提示腎臟損傷。PAS染色可見高果糖組大鼠腎小球系膜細胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮空泡及顆粒變性，隨時間延長，病變加重，腎間質(zhì)及小血管未見明顯病變。

FXR是1995年首先克隆和命名的，在肝臟、小腸、腎臟和腎上腺高表達，在脂肪和心臟中低表達，F(xiàn)XR蛋白有典型的核受體結(jié)構(gòu)〔2〕。FXR的生物學(xué)主要進展是發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以作為此核受體的內(nèi)源性配體，生理濃度下的多種初級和次級膽汁酸以及一些多不飽和脂肪酸可激活FXR〔7〕。FXR參與膽汁酸代謝，參與調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝，與多種疾病密切相關(guān)。

在脂代謝過程中，F(xiàn)XR能調(diào)節(jié)磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)的表達，加速磷脂和膽固醇從富含TG的脂蛋白向高密度脂蛋白轉(zhuǎn)運〔8〕;FXR還能上調(diào)肝細胞膜上的清道夫受體B(cavenger receptor B1，SR-B1)，從而增加高密度脂蛋白介導(dǎo)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運〔9〕。FXR能通過調(diào)控脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)、微粒體TG轉(zhuǎn)移蛋白 (microsomal triglyceride transfer protein，MTP)，調(diào)節(jié)TG代謝。人體內(nèi)，F(xiàn)XR可調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)活性，膽汁酸激活 FXR可通過 SHP下調(diào)SREBP-1c的表達最終使血漿中TG含量減少〔10〕。因此，激活FXR就能夠降低TG，從而對腎臟起保護作用。

本研究免疫組織化學(xué)表明，F(xiàn)XR在正常大鼠腎臟組織中主要分布在近曲小管，高果糖組大鼠FXR在上述區(qū)域的表達顯著下調(diào)，隨病程延長，表達減弱。表明腎臟的固有細胞均參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，高果糖飲食可導(dǎo)致大鼠高TG血癥并使健康大鼠出現(xiàn)顯著的腎臟病理損害。因此，選擇健康的生活方式，積極控制高TG血癥對防治或延緩腎臟疾病進行性惡化具有十分重要的現(xiàn)實意義。

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