微波消融聯(lián)合消融灶周邊注射CpG ODN誘導(dǎo)抗小鼠肝癌免疫效應(yīng)①

向邦德 劉 星 蔣文超 趙蔭農(nóng) 黎樂群 (廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科,南寧530021)

消融治療已成為肝癌治療的有效手段。消融治療不但能直接殺死腫瘤細胞,其熱效應(yīng)也能促使腫瘤抗原的暴露和釋放,在一定程度上誘導(dǎo)宿主主動免疫效應(yīng)[1],但因為這種效應(yīng)微弱,并不能產(chǎn)生具有實際意義的免疫治療效果,所以腫瘤高復(fù)發(fā)趨勢是肝癌消融治療面臨的最大難題之一。含胞嘧啶-磷酸鹽-鳥嘌呤基序的寡脫氧核苷酸(Cytidine-phosphatte-guanine oligodeoxynucleotides,CpG ODN)是一類以非甲基化CpG為核心的寡聚脫氧核苷酸序列,作為一種免疫佐劑能激活各種免疫細胞[2]。本研究旨在探討消融灶周圍注射CpG ODN誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)的效能,為消融聯(lián)合免疫治療防治肝癌復(fù)發(fā)提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞株 雌性C57BL/6J小鼠,4～6周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。Hepa 1-6小鼠肝癌細胞株,購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。來源于C57BL/6J的B16黑色素瘤細胞株購于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.2 主要設(shè)備 FORSEAMTC-3微波消融治療儀(南京慶海微波電子研究所),頻率2 450 MHz,功率輸出范圍5～120 W,18 G電極針,微波輻射芯線長0.3 mm。數(shù)字化溫度控制器(日本PKC器械公司),20 G測溫針,分辨率0.5℃。

1.3 主要試劑 LDH試劑盒購于美國Promega公司,CpGODN1826 序 列 為 5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′,由上海生工生物工程有限公司合成,以無菌生理鹽水配成1 g/L溶液,-20℃條件下保存。IL-12和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。CD8、CD4兔抗鼠單克隆抗體購自福州邁新生物有限責任公司。HSP70免疫組化單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology。

1.4 模型建立 Hepa 1-6肝癌細胞常規(guī)傳代培養(yǎng),收集對數(shù)生長期的細胞,用PBS配成2×1010cells/L的細胞液,在無菌條件下在小鼠單側(cè)或雙側(cè)腹部皮下注射0.1 ml瘤細胞懸液,建立單側(cè)或雙側(cè)皮下肝癌模型。7天后可捫及皮下結(jié)節(jié),待腫瘤長徑至9～10 mm時進行實驗。

1.5 小鼠肝癌微波消融 參見文獻[3]接通微波消融治療儀對肝癌消融,輸出功率為5 W,根據(jù)測溫調(diào)在85℃～95℃,3分鐘的條件下完全消融腫瘤,消融結(jié)束后縫合皮膚切口。

1.6 免疫治療實驗分組及方法

1.6.1 取雙側(cè)皮下肝癌模型鼠,隨機分為4組。①聯(lián)合治療組:右側(cè)腫瘤進行微波消融,再于消融后10分鐘、第 3天、第5天在消融灶周邊多點注射1 g/L的CpG ODN溶液0.1 ml;②消融治療組:右側(cè)腫瘤進行微波消融,再于消融后10分鐘、第3天、第5天在消融灶周邊多點注射PBS 0.1 ml;③CpG ODN治療組:右側(cè)腫瘤不作消融治療,僅于第1、3、5天在腫瘤周邊多點注射1 g/L的CpG ODN溶液0.1 ml;④對照組:右側(cè)腫瘤不作治療。左側(cè)腫瘤均不作任何治療。

1.6.2 檢測左、右側(cè)腫瘤體積變化 各組取12只小鼠,在末次注射CpG ODN后,每5天用游標卡尺測量兩側(cè)腫瘤大小,觀察各組小鼠腫瘤體積變化。腫瘤體積公式:腫瘤體積(mm3)=a×b2/2,a為腫瘤長徑,b為短徑。

1.6.3 在末次注射CpG ODN第15天,各組處死6只小鼠,取左側(cè)腫瘤組織、小鼠血清和分離脾淋巴細胞進行以下檢測:①免疫組化檢測CD4、CD8 T淋巴細胞在左側(cè)腫瘤組織數(shù)量:取左側(cè)腫瘤組織標本行CD4、CD8 T細胞免疫組化染色,步驟按照邁新生物公司試劑盒說明書操作;采用DAB染色,陽性細胞為胞漿及胞膜染色。由2位病理科醫(yī)生在顯微鏡下對1張切片連續(xù)隨機計數(shù)3個400倍視野內(nèi)的全部陽性染色細胞,每個標本計數(shù)3張切片,計算出每個400倍視野內(nèi)陽性細胞的均數(shù)進行統(tǒng)計分析。②血清中IL-12和IL-10水平測定:荷瘤小鼠摘眼球取血,制備血清,分別用小鼠IL-12和IL-10 ELISA試劑盒測試小鼠血清中IL-12和IL-10含量,操作方法參照試劑盒說明書進行,結(jié)果經(jīng)計算機處理得到血清中IL-12和IL-10含量。③乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)釋放法檢測脾CTL細胞毒性:參見文獻[4],以Hepa 1-6肝癌細胞和B16黑色素瘤細胞作為靶細胞,效靶比為20∶1,按照LDH試劑盒操作說明進行。細胞毒活性(%)=[實驗組A值均數(shù)-效應(yīng)細胞自然釋放組A值均數(shù)-靶細胞自然釋放組A值均數(shù)]/[靶細胞最大釋放組A值均數(shù)-靶細胞自然釋放組A值均數(shù)]×100%。殺傷實驗重復(fù)3次。④免疫組織化學(xué)染色檢測HSP70表達:每組取6只小鼠,消融治療后24小時,頸椎離斷法處死小鼠,取得肝癌標本,CpG ODN治療組在第1次瘤周注射CpG ODN后24小時處死小鼠。每個標本制作三張切片,免疫組化步驟按照Santa公司試劑盒說明書操作;采用DAB染色,陽性細胞為胞漿或胞核染色。計數(shù)方法:每張切片在400倍光鏡下由2位病理科醫(yī)生分別計數(shù)5個隨機視野內(nèi)陽性細胞數(shù)Pxi與測試視野細胞總數(shù)Pri,按Weibel法[5],計算陽性細胞標記指數(shù)(Labeling index,LI),LI(%)=∑Pxi/∑Pri×100%,∑Pxi為每張切片5個隨機視野陽性細胞數(shù)總和,∑Pri為每張切片5個隨機視野細胞數(shù)總和。每個標本計數(shù)3張切片,取其平均值為該小鼠的LI進行統(tǒng)計分析。

1.7 免疫保護實驗 制作單側(cè)皮下肝癌模型小鼠,隨機分為2組,聯(lián)合治療組:消融灶周邊注射CpG ODN;消融治療組:消融灶周邊注射PBS。消融方法、CpG ODN和PBS注射方法同前,消融治療30天后,分別取兩組中腫瘤部分縮小或完全消退的小鼠各12只,在對側(cè)腹部皮下再次接種2×106個Hepa 1-6細胞。檢測再接種腫瘤的成瘤率和體積變化。

1.8 統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析;計量資料以 x—±s表示,各組之間計量資料先進行單因素方差分析,若有差別再用Student-Newman-Keuls進行組間的兩兩比較,方差不齊時用Tamhane法進行組間兩兩比較。小鼠生存時間比較用Log-Rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤鼠腫瘤生長一般情況 C57BL/6J小鼠皮下接種Hepa 1-6細胞腫瘤成瘤率90%,7天左右腫瘤長徑達6～10 mm,此時分別予以相關(guān)治療。微波消融24小時內(nèi)小鼠死亡率為5.8%。

2.2 雙側(cè)皮下肝癌模型兩側(cè)腫瘤體積的變化 消融治療組和聯(lián)合治療組右側(cè)腫瘤經(jīng)微波消融后腫瘤體積顯著小于對照組,且20天內(nèi)均無明顯增大。但CpG ODN治療組腫瘤仍然有增大趨勢,在治療后第20天接近對照組(圖1)。左側(cè)未治療的腫瘤體積在第10、15、20天時聯(lián)合治療組明顯低于其他3組,而消融治療組和CpG ODN治療組接近對照組,顯著高于聯(lián)合治療組,但兩組腫瘤生長曲線未見明顯分離(圖2)。

2.3 小鼠雙側(cè)皮下肝癌治療后生存時間的比較各組中位生存時間分別為:聯(lián)合治療組73天、消融治療組60天、CpG ODN治療組55天和對照組38天。聯(lián)合治療組生存時間明顯長于其他3組(P＜0.05,Log-Rank test)。生存曲線見圖3。

2.4 左側(cè)(未治療側(cè))腫瘤組織CD4、CD8 T淋巴細胞數(shù)量 CD4和CD8 T淋巴細胞胞漿染成棕黃色(圖4)。CD8 T淋巴細胞數(shù)量在聯(lián)合治療組、消融治療組和CpG ODN治療組明顯高于對照組,且聯(lián)合治療組明顯高于消融治療組和CpGODN治療組;而CD4 T淋巴細胞在各組腫瘤組織內(nèi)無明顯差別(表1)。

圖1 小鼠雙側(cè)皮下肝癌右側(cè)腫瘤(治療側(cè))生長曲線(n=12)Fig.1 Right tumor(treated tumor)growth curve in bilateral liver cancer murine models(n=12)

圖2 小鼠雙側(cè)皮下肝癌左側(cè)腫瘤(未治療側(cè))生長曲線(n=12)Fig.2 Left tumor(no-treated tumor)growth curve in bilateral liver cancer murine models(n=12)

2.5 血清中IL-12和 IL-10含量 IL-12和 IL-10含量在各組間兩兩比較均有顯著性差異,進一步分析發(fā)現(xiàn)IL-12在聯(lián)合治療組小鼠血清中含量顯著高于其他3組,IL-10在聯(lián)合治療組小鼠血清中含量顯著低于其他3組(表2)。

2.6 雙側(cè)皮下肝癌小鼠脾CTL細胞毒性 在聯(lián)合治療組中脾CTL細胞對Hepa 1-6殺傷率顯著高于其他3組,CpGODN治療組對Hepa1-6殺傷率顯著高于消融治療組和對照組,而各組對B16細胞殺傷率無明顯差異。

圖3 小鼠雙側(cè)皮下肝癌右側(cè)腫瘤不同方式治療后各組小鼠生存曲線(n=12)Fig.3 Survival curves of bilateral liver cancer murine models after the right tumors were given different treatment(n=12)

圖4 小鼠雙側(cè)皮下肝癌左側(cè)未治療腫瘤組織內(nèi)CD8 T淋巴細胞免疫組化染色(SP,×200)Fig.4 CD8 T lymphocytes in the left tumor tissues(no-treated tumor)of bilateral liver cancer murine models detected by immunochemistry staining(SP,×200)

2.7 右側(cè)(治療測)腫瘤標本HSP70表達量的比較消融治療后24小時,各組右側(cè)(治療測)腫瘤標本HSP70陽性表達呈胞漿或胞核棕黃色(見圖5)。HSP70標記指數(shù)(LI%)分別為:①聯(lián)合治療組:(39.95±9.03)%;②消融治療組:(33.90±7.98)%。③CpG ODN治療組:(10.70±4.23)%;④對照組:(8.83±3.14)%;聯(lián)合治療組與消融治療組明顯高于對照組和CpG ODN治療組(P＜0.05)。

表1 小鼠雙側(cè)皮下肝癌左側(cè)未治療腫瘤組織內(nèi)CD8、CD4 T淋巴細胞數(shù)比較(n=6,±s)Tab.1 The number of CD8 and CD4 T lymphocytes in the left tumor tissues(no-treated tumor)of bilateral liver cancer murine models(n=6,±s)

表1 小鼠雙側(cè)皮下肝癌左側(cè)未治療腫瘤組織內(nèi)CD8、CD4 T淋巴細胞數(shù)比較(n=6,±s)Tab.1 The number of CD8 and CD4 T lymphocytes in the left tumor tissues(no-treated tumor)of bilateral liver cancer murine models(n=6,±s)

Note:1)P＜0.05 vs ablation therapy group and CpG ODN therapy group;2)P＜0.05 vs combination therapy group,ablation therapy group,and CpG ODN therapy group.

images/BZ_10_1088_822_2029_864.pngCombination therapy 25.17±5.461) 15.50±4.04 Ablation therapy 18.33±4.08 20.33±5.54 CpG ODN therapy 17.00±7.95 18.33±6.74 Control 7.167±4.072) 19.33±7.03

表2 雙側(cè)皮下肝癌小鼠治療后血清中IL-12和IL-10比較(n=6,±s)Tab.2 Serum concentration of IL-12 and IL-10 in bilateral liver cancer murine groups given different therapy(n=6,±s)

表2 雙側(cè)皮下肝癌小鼠治療后血清中IL-12和IL-10比較(n=6,±s)Tab.2 Serum concentration of IL-12 and IL-10 in bilateral liver cancer murine groups given different therapy(n=6,±s)

Note:1)P＜0.05 vs ablation therapy group,CpG ODN therapy group and control group;2)P＜0.05vs combination therapy group,ablation therapy group,and CpG ODN therapy group.

Groups Serum concentration(ng/L)IL-12 IL-10 Combination therapy 228.40±17.051) 226.34±19.161)Ablation therapy 171.46±9.05 289.07±23.35 CpG ODN therapy 207.16±14.12 316.25±14.53 Control 106.97±11.1642) 358.70±23.152)

圖5 小鼠雙側(cè)皮下肝癌右側(cè)(治療側(cè))腫瘤組織內(nèi)HSP免疫組化染色(SP,×200)Fig.5 Expression of HSP in the right tumor tissues(treated tumor)of bilateral liver cancer murine modelsdetected by immunochemistry staining(SP,×200)

表3 雙側(cè)皮下肝癌小鼠在治療后脾CTL細胞對不同靶細胞殺傷率比較(%,±s,n=6)T ab.3 Cytotoxicities of CTL to different target cell in bilateral liver cancer murine groupsgiven different therapy(%,±s,n=6)

表3 雙側(cè)皮下肝癌小鼠在治療后脾CTL細胞對不同靶細胞殺傷率比較(%,±s,n=6)T ab.3 Cytotoxicities of CTL to different target cell in bilateral liver cancer murine groupsgiven different therapy(%,±s,n=6)

Note:1)P＜0.05 vs ablation therapy group,CpG ODN therapy group and control group;2)P＜0.05 vs ablation therapy group and control group.

images/BZ_11_38_472_983_572.png Combination therapy 57.26±3.671) 32.54±3.83 Ablation therapy 33.20±3.82 30.66±4.95 CpG ODN therapy 42.98±3.412) 32.58±4.42 Control 30.38±3.74 33.05±3.74

圖6 聯(lián)合治療組(n=7)和消融治療組(n=10)再接種腫瘤生長曲線Fig.6 Rechallenged tumor growth curve in combination therapy group(n=7)and ablation therapy group(n=10)

2.8 再接種腫瘤的成瘤率和腫瘤體積變化 聯(lián)合治療組再接種的腫瘤成瘤率為 58.33%(7/12),而消融治療組的成瘤率為83.33%(10/12)。對于已經(jīng)成瘤的小鼠,聯(lián)合治療組的腫瘤體積在第20天后明顯小于消融治療組(圖6)。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):當雙側(cè)皮下肝癌小鼠一側(cè)腫瘤消融治療后輔以局部注射CpG ODN,另一側(cè)腫瘤生長速度明顯受到抑制,且該組小鼠中位生存時間明顯長于其他各組,表明局部注射CpG ODN聯(lián)合消融治療能誘導(dǎo)顯著的抗腫瘤效應(yīng)。

最近研究表明瘤周注射CpG ODN抑制胸膜間皮瘤、黑色素瘤等腫瘤的生長和遠處轉(zhuǎn)移,這種抗瘤效果與CpG ODN趨化各種免疫細胞遷移到腫瘤組織周邊、增強DC遞呈腫瘤抗原的能力、激活CD4+T細胞和CD8+細胞介導(dǎo)的細胞免疫相關(guān)[6,7]。

我們的結(jié)果顯示聯(lián)合治療組中未治療側(cè)的腫瘤組織內(nèi)CD8+T細胞數(shù)量明顯增多,但CD4+T細胞未見明顯增多。聯(lián)合治療組中分離的脾淋巴細胞對Hepa 1-6細胞殺傷率為(57.26±3.67)%,亦顯著高于其他各組,但各組對B16黑色素瘤細胞殺傷率無顯著差別。上述結(jié)果表明CpG ODN聯(lián)合消融治療能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生以CTL為主的特異性細胞免疫效應(yīng),抑制未治療側(cè)腫瘤生長。我們推測上述效應(yīng)與瘤周注射CpG ODN有關(guān)。CpG ODN能與多種免疫細胞如樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)、單核巨噬細胞的細胞因子受體Toll樣受體-9(Toll like receptor-9,TLR9)結(jié)合后,通過胞吞的形式進入細胞,并進一步與內(nèi)體融合,在內(nèi)體的酸性環(huán)境中通過一些列信號傳導(dǎo)途徑,激活多種免疫細胞,從而抑制腫瘤的生長[8]。

本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組血清中以IL-12為代表的Th1細胞因子水平明顯增高,以IL-10為代表的Th2細胞因子則顯著下降,在一定程度上表明CpG ODN聯(lián)合消融治療能促使宿主體內(nèi)Th1/Th2細胞平衡向Th1細胞偏移,增強了機體的抗瘤免疫功能[9]。這可能由于CpG ODN與消融組織內(nèi)DC或巨噬細胞的TLR-9結(jié)合后,使IL-12分泌增多,抑制IL-10的產(chǎn)生。

HSP70是正常生理條件下低水平表達,當細胞面臨受熱、缺血、缺氧等刺激時,其合成明顯增多。HSP70主要功能是作為“分子伴侶”結(jié)合并參與提呈腫瘤抗原,使抗原能高效的被DC捕獲,再進一步激活T淋巴細胞,發(fā)揮其特異性殺傷腫瘤的作用[10]。在我們的實驗中,HSP70標記指數(shù)在聯(lián)合治療組與消融治療組明顯高于對照組和CpG ODN治療組,說明熱消融能刺激腫瘤細胞HSP70表達,發(fā)揮其分子伴侶的功能,產(chǎn)生抗腫瘤的免疫效應(yīng)。由于消融能促進HSP70的表達,HSP70與消融后暴露的腫瘤抗原結(jié)合,呈遞給被CpG ODN激活的DC,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強大的免疫反應(yīng),同時還能直接激活CTL,雙重作用下,促進機體產(chǎn)生強烈的抗腫瘤反應(yīng)。

單側(cè)皮下肝癌模型小鼠的腫瘤經(jīng)聯(lián)合治療或僅消融治療后,30天后對于腫瘤縮小或完全消失的小鼠,在對側(cè)腹部皮下再次接種同種腫瘤細胞,結(jié)果表明聯(lián)合治療組的成瘤率明顯低于單獨消融組,且已成瘤的小鼠腫瘤生長也明顯比消融治療組緩慢,充分說明這種抗腫瘤的免疫效應(yīng)能在體內(nèi)維持一定時間。

本研究表明,消融滅活的腫瘤能為抗腫瘤免疫效應(yīng)提供有效的抗原,CpG ODN則能激活免疫細胞并攝取這些抗原,從而產(chǎn)生較為強烈的抗腫瘤效應(yīng)。因此,消融聯(lián)合局部注射CpG ODN對防治消融后腫瘤復(fù)發(fā)具有良好的應(yīng)用前景。

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