聯(lián)合免疫療法治療小鼠肝癌移植瘤模型的研究①

傅慶國(guó) 朱林波 李 曄 應(yīng)可明 (寧波市第二醫(yī)院腫瘤外科,寧波 315010)

隨著腫瘤免疫學(xué)的研究進(jìn)展,腫瘤免疫治療的作用和地位已經(jīng)逐漸提高,同時(shí),國(guó)內(nèi)外的研究已經(jīng)證明,腫瘤免疫抑制是制約腫瘤免疫治療效果的一個(gè)重要因素[1,2],腫瘤細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子、腫瘤抗原凋變和免疫逃逸、單一的免疫治療方案等因素影響了免疫治療的效果,對(duì)抗腫瘤免疫而言,自然殺傷細(xì)胞(Natural Killers,NKs)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)具有重要的作用,所以要提高腫瘤免疫治療效果應(yīng)采用系統(tǒng)的聯(lián)合免疫治療方法,包括基礎(chǔ)免疫調(diào)節(jié)、非特異性免疫治療和特異性免疫治療方法。根據(jù)上述原則,所采用的藥物或者技術(shù)也分為三類:

第一類為免疫調(diào)節(jié)劑:以改善調(diào)節(jié)免疫功能、或促進(jìn)免疫細(xì)胞分化增殖、改善其活性和促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生的藥物[3],如左旋咪唑、香菇多糖、細(xì)胞因子,多種天然免疫調(diào)節(jié)藥物等,這類藥物一般不引起免疫反應(yīng),在本研究中以福建仙芝樓公司提供的靈芝粉為基礎(chǔ)免疫調(diào)節(jié)藥物,其主要的免疫調(diào)節(jié)有效成分為靈芝多糖和三萜類。

第二類為非特異性抗腫瘤免疫制劑,能夠引起機(jī)體的免疫反應(yīng),以活化NK細(xì)胞,強(qiáng)化固有免疫為主,當(dāng)然也有免疫調(diào)節(jié)作用,本研究中以CpG-A基序?yàn)榈诙愃幬颷4,5],CpG-A除具有很強(qiáng)的活化NK細(xì)胞的活性,促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的成熟,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能外,也可促進(jìn)某些Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如 IFN-γ,而IFN-γ能促進(jìn)或上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC分子,這一作用對(duì)第三步的特異性免疫治療十分有益。

第三類為特異性抗腫瘤免疫制劑。多數(shù)為來源于腫瘤組織或細(xì)胞的治療性腫瘤疫苗,活化腫瘤特異性的CTL,引發(fā)特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答。本研究中以自小鼠腫瘤細(xì)胞中提取的腫瘤熱休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)為第三類藥物[6-8]。HSP70是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的一種重要腫瘤抗原,其在很多人類及動(dòng)物的腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)率很高,腫瘤表達(dá)的HSP70可結(jié)合多種腫瘤抗原肽,可遞呈多個(gè)供T淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原表位,故有學(xué)者稱其扮演了細(xì)胞總肽庫(kù)的角色,可活化多個(gè)克隆的CTL,較單一抗原活化的CTL殺傷更多的腫瘤細(xì)胞,同時(shí)腫瘤HSP70具有更強(qiáng)的活化DC功能,可有效地完成抗原遞呈;HSP70除主要活化誘導(dǎo)CD8+的T淋巴細(xì)胞外,也可活化CD4-、CD8-的T淋巴細(xì)胞,γ δ+T 淋巴細(xì)胞,其殺傷活性是不受MHCⅠ類分子限制的,還將殺死那些對(duì)NK抵抗的腫瘤細(xì)胞,所以HSP70作為治療性腫瘤疫苗具有較其它腫瘤抗原明顯的優(yōu)越性,是一良好的適宜抗原,可完全滿足表達(dá)率高、特異性強(qiáng)、多克隆活化等方面的要求,故本研究將以腫瘤HSP70作為特異性的抗腫瘤免疫制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡、雌性清潔級(jí)(SPF)C57BL/6j近交系小鼠,體重16～18克,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005,飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

閩北地區(qū)宗族制度鼎盛。宗族，血緣是維系鄉(xiāng)土村落的重要紐帶，古民居的聚落布局多表現(xiàn)為以宗祠或祖廟為中心聚族而居的形式。這種由血緣派生的建筑空間關(guān)系，首先強(qiáng)調(diào)的是宗祠的地理位置，或以宗祠，祖廟為中心展開外擴(kuò)布局，村民們的宗族觀念也很強(qiáng)，因此村落布局的結(jié)構(gòu)便打上了宗族關(guān)系的烙印，甚至反映了各姓氏宗族本身的結(jié)構(gòu)。宗祠常位于村落的山脊高點(diǎn)，或是置于道路交通的樞紐位置，或分別以宗祠和支祠為中心形成組團(tuán)布局，呈現(xiàn)出一種高度向心的空間布局結(jié)構(gòu)。在閩北武夷山，這種以宗祠血緣派生為中心的古民居聚落的布局形式極為普遍，如城村、程村、下梅、黃村、吳屯、宵墩、翁屯、翁墩、五夫等，其他各地也有少量的血緣村落。

字，我一定會(huì)簽。你看能不能各退一步，家產(chǎn)一人一半我絕對(duì)贊成，離婚不離家我也贊成，但是，我不放心孩子。高考的節(jié)骨眼上，我們不能因?yàn)樽运胶雎粤诉@件事對(duì)他帶來的影響。你說呢？

1.1.3 靈芝孢子粉劑 由福建仙芝樓生物科技有限公司提供,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)食健字G20060726,產(chǎn)品批號(hào)1011011,密封、陰涼處保存,超純水溶解后使用。

1.2 方法

1.1.5 HSP70-PCs的制備和檢測(cè)分析 首先大量擴(kuò)增小鼠的肝癌細(xì)胞,然后低滲裂解,超聲破碎,依次過ConA Sepharose和DEAE層析純化,再經(jīng)過SDSPAGE和 Western blot檢測(cè),純度達(dá)90%以上。常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和檢測(cè),無細(xì)菌生長(zhǎng)。凍干后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)特發(fā)性炎性腸病患者予以跨理論模型聯(lián)合動(dòng)機(jī)性訪談干預(yù)能夠有效提高其自我效能感，動(dòng)機(jī)性訪談與跨理論模型干預(yù)有效結(jié)合，其是以跨理論模型作為框架，并將對(duì)患者的健康教育分為意圖轉(zhuǎn)變時(shí)期、行為落實(shí)時(shí)期，其中，在意圖轉(zhuǎn)變時(shí)期患者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到不良的生活習(xí)慣、不遵醫(yī)行為會(huì)再次誘發(fā)加重特發(fā)性炎性腸病，但出于進(jìn)退兩難，此時(shí)給予動(dòng)機(jī)性訪談為主，以此挖掘患者的行為改變動(dòng)機(jī)，不斷增強(qiáng)患者的自我管理能力意識(shí)，在行為落實(shí)時(shí)期的主要內(nèi)容是建立互幫互助小組或成立特發(fā)性炎性腸病病友會(huì)，以此確保健康教育的實(shí)施連續(xù)性，對(duì)增強(qiáng)患者的自我效能感方面具有積極肯定的價(jià)值[14-15]。

1.1.6 主要試劑及儀器

1.1.6.1 主要試劑 ConA Sepharose、DEAE-52均購(gòu)自瑞典GE Healthcare公司,低分子量蛋白質(zhì) Marker 和堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)Bio-Science公司,小鼠抗小鼠HSP70單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,小鼠 IFN-γ、CXCL-9及CXCL-10 ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

“他們?nèi)齻€(gè)大仙兒，”克里斯蒂娜依次指了指皮特、德魯和莫莉，“實(shí)際上，白娘胎里爬出來就整天湊在一起。我特別討厭他們?！?/p>

1.1.6.2 主要儀器 超速離心機(jī)(日本HIT ACHI公司),SDS-PAGE電泳儀、濕轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司),超級(jí)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司),全自動(dòng)蛋白純化系統(tǒng)AKTA basic PH/C 100(瑞典Amersham公司)。以上儀器均為本實(shí)驗(yàn)室固有財(cái)產(chǎn)。

1.1.4 CpG-ODN CpG 基序 序列為 5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′,含有兩個(gè)CpG 基序,非甲基化,為抵抗核酸酶的作用,對(duì)其兩端堿基進(jìn)行硫代磷酸化修飾,純化方式為HPLC,由大連寶生物工程有限公司合成,干粉-20℃保存,用無菌PBS溶解稀釋后使用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)用±s表示。

1.2.2 腫瘤HSP70-PCs分離和純化方法參照文獻(xiàn)[6,7]進(jìn)行。

由表 2可知，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在1~5000 ng·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)時(shí)，采用該檢測(cè)方法得到的3種合成麝香的峰面積比與相應(yīng)的實(shí)際濃度比的相關(guān)系數(shù)都在0.996以上，二者呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，因此可據(jù)此相關(guān)方程來計(jì)算樣品中目標(biāo)分析物的濃度。HHCB、AHTN和MK的檢出限分別為0.02、0.03 和 0.03 ng·L-1，其回收率分別為(114%±15%)、(107%±11%)和(90%±17%)，由此可知，3種合成麝香的檢出限較低且回收率均較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度較高。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種及分組方案 將實(shí)驗(yàn)小鼠第0天右側(cè)背部皮下接種上述活腫瘤細(xì)胞Hepa 1-6懸液0.1 ml,即4×106/只,第7天均可觸及米粒大小皮下結(jié)節(jié),將荷瘤小鼠隨機(jī)分成9組,每組10只:生理鹽水對(duì)照組1(N1組)、生理鹽水對(duì)照組2(N2組)、靈芝孢子粉組(L組)、CpG-ODN治療組(C組)、HSP70-PCs治療組(H組)、靈芝孢子粉+CpG-ODN聯(lián)合治療組(L+C組)、靈芝孢子粉+HSP70-PCs聯(lián)合治療組(L+H組)、CpG-ODN+HSP70-PCs聯(lián)合治療組(C+H組)和靈芝孢子粉+CpG-ODN+HSP70-PCs聯(lián)合治療組(L+C+H組)。

1.2.4 給藥方案

村鎮(zhèn)銀行信貸風(fēng)險(xiǎn)內(nèi)部審計(jì)，要精心設(shè)計(jì)審計(jì)制度，抓住審計(jì)重點(diǎn)，把握關(guān)鍵環(huán)節(jié)，優(yōu)化溝通機(jī)制，確保機(jī)構(gòu)和人員獨(dú)立性，強(qiáng)化人才培養(yǎng)，提升人員專業(yè)勝任能力。綜合運(yùn)用各種設(shè)計(jì)方法和技巧，提升信貸風(fēng)險(xiǎn)內(nèi)部審計(jì)的質(zhì)量和效率。

1.2.4.2 L組、L+C組、L+H組及L+C+H組于接種腫瘤細(xì)胞的前10天開始灌胃給予靈芝孢子粉劑,按4 g/kg體重劑量給藥,每天灌胃一次,0.2 ml/只,直至實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)瘤株 由C57BL/6j小鼠正常上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化而成肝癌細(xì)胞株Hepa 1-6,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2.4.3 C組、L+C組、C+H組及L+C+H組于實(shí)驗(yàn)小鼠荷瘤第7天,開始瘤旁皮下注射:CpG-ODN 100 μ g/(0.1 ml·只),以后每周兩次,共注射 8次 。

HY-82型油炸鍋：雙缸雙篩電熱炸爐；C21-SDHC15K型電磁爐：浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；ACS-30型電子計(jì)價(jià)秤：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；BCD-196KDA型冰箱：海爾集團(tuán)股份有限公司；其他設(shè)備：由食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.4.4 H組、L+H組、C+H組及L+C+H組于實(shí)驗(yàn)小鼠荷瘤第10天,開始小鼠左側(cè)背部皮下注射HSP70-PCs,10 μ g/(0.1 ml·只),每周一次 ,共免疫 4 次 。

1.2.5 觀察與檢測(cè)方法 當(dāng)N1組荷瘤小鼠死亡一半(5只)時(shí),N2組和CpG組分別取出5只小鼠,摘眼球法采血,吸取上層血清用于細(xì)胞因子IFN-γ及趨化性細(xì)胞因子CXCL-9、CXCL-10水平的檢測(cè),具體檢測(cè)方法參照試劑盒使用說明。其余的作為生存時(shí)間及生存率的觀察分析。每3天測(cè)量瘤體的最大直徑(a)及橫徑(b)一次,運(yùn)用公式V=π/6×a×b2來算出瘤體的體積大小。對(duì)于死亡的小鼠,先行切下腫瘤稱重,再收集腹水,打開腹腔、胸腔,檢查肝脾肺等器官,如發(fā)現(xiàn)肝脾肺等處有轉(zhuǎn)移灶切下,收集稱重、保存,并記錄好生存時(shí)間及上述各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.2.1 細(xì)胞收集 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞Hepa 1-6,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、1 000 r/min,6分鐘離心,棄上清,重復(fù)2次,PBS緩沖液重懸細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)得活細(xì)胞比例為96%,調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107ml-1。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤HSP70-PCs的分離純化與檢測(cè)分析 經(jīng)過2次分離得到的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分子量為70 kD, Western blot分析后證明為腫瘤HSP70。結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa 1-6 HSP70 SDS-PAGE檢測(cè)和 Western blot結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE and Western blot of HSP70 extracted from Hepa 1-6 cells

2.2 肝癌移植瘤模型的建立情況 小鼠肝癌細(xì)胞Hepa 1-6按 4×106/只的濃度接種于C57BL/6j小鼠,成瘤率100%,并于接種后第7天可捫及米粒大小的皮下腫瘤結(jié)節(jié),未出現(xiàn)腫瘤接種性死亡。

2.3 小鼠皮下肝癌生存曲線 根據(jù)每3天測(cè)量的皮下瘤體長(zhǎng)、短徑,運(yùn)用公式:V=π/6×a×b2(mm3)得出腫瘤體積,繪出小鼠皮下肝癌移植瘤生存曲線(見圖2)。

1.2.4.1 N1組、N2組于荷瘤第7天開始瘤旁皮下注射:0.9%NaCl 0.1 ml/只。

總而言之，在國(guó)慶期間的出口利好過去之后，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)重回博弈臺(tái)。內(nèi)需不旺基本算是唯一的利空因素，但已呈常態(tài)化的幾項(xiàng)利好因素也難以為高價(jià)尿素提供更多的上漲可能。短期內(nèi)，10月份市場(chǎng)難有大幅波動(dòng)，在月底或有小幅跌勢(shì)，跌幅在50元/噸以內(nèi)。11月份市場(chǎng)不確定因素較多，大概會(huì)迎來一波漲勢(shì)。即將召開的磷復(fù)肥產(chǎn)銷會(huì)，或?qū)⒊蔀槟蛩囟瑑?chǔ)大面積啟動(dòng)的契機(jī)。

圖2 各組小鼠的腫瘤在8次治療中的體積變化(mm3)Fig.2 Tumor volume of mice in eight different treated groups(mm3)

表1 各組的腫瘤體積、腫瘤重量、轉(zhuǎn)移率及生存時(shí)間(±s,n=5)Tab.1 Tumor volume,tumor weight and metastasia rate in eight different treated groups(±s,n=5)

表1 各組的腫瘤體積、腫瘤重量、轉(zhuǎn)移率及生存時(shí)間(±s,n=5)Tab.1 Tumor volume,tumor weight and metastasia rate in eight different treated groups(±s,n=5)

Note:L-L+C+H vs Control,P＜0.01.L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01.L-L+C+H vs Control,P＜0.01.L-L+C+H vs Control,P＜0.01.

Groups Tumor volume(mm3) Tumor weight(g) Metastasia rate(%) Survival rate(%)Control 7 882.4±682.3 5.26±0.42 50 0 L 3 984.4±2 386.6 2.58±1.71 20 20 C 1 896.0±1 723.5 1.46±1.40 0 40 H 1 777.4±1 679.5 1.40±1.32 0 40 L+H 1 141.6±1 049.6 0.80±0.73 0 40 L+C 0 0 0 100 C+H 0 0 0 100 L+C+H 0 0 0 100

圖3 小鼠腫瘤切除標(biāo)本Fig.3 Tumors excised from miceNote:From left to right:Control group,L group,C group,H group,L+H group,all tumors of L+C group,C+H group and L+C+H group disappeared.

表2 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9、CXCL-10水平(n=5,pg/ml, ±s)Tab.2 IFN-γ,CXCL-9 and CXCL-10 level in serum of mice of eight different treated groups(n=5,pg/ml,±s)

表2 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9、CXCL-10水平(n=5,pg/ml, ±s)Tab.2 IFN-γ,CXCL-9 and CXCL-10 level in serum of mice of eight different treated groups(n=5,pg/ml,±s)

Note:L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01;L vs Control,P＜0.05;C-L+C+H vs Control,P＜0.01;L-L+C+H vs Control,P＜0.01.

Groups IFN-γ CXCL-9 CXCL-10 Control 21.7±2.0 330.7±13.5 317.5±10.5 L 26.9±1.2 461.0±12.9 422.8±24.4 C 38.4±1.9 578.6±11.2 498.4±13.0 H 35.7±1.1 511.4±8.7 505.8±16.4 L+H 42.3±2.2 581.6±14.2 586.0±15.7 L+C 60.0±1.8 608.8±14.1 611.8±14.9 C+H 49.9±1.5 770.2±14.9 690.5±12.5 L+C+H 69.9±3.7 947.4±31.1 828.0±12.5

2.5 各組小鼠外周血中 IFN-γ、CXCL-9及CXCL-10水平(pg/ml,±s) 經(jīng)治療后,上述幾種細(xì)胞因子,均有不同程度的提高,證明這三種免疫制劑對(duì)Th1的細(xì)胞因子和趨化因子有促升作用,但以聯(lián)合應(yīng)用的最明顯,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05～P＜0.01,見表2)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能低下有著互為因果的聯(lián)系,腫瘤細(xì)胞可以分泌多種免疫抑制性的細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming Growth Factor β,TGF-β)、白細(xì)胞介素 10(Interleukin-10,IL-10)、巨噬細(xì)胞(Macrophage,MΦ)和遷移抑制因子(Macrophage Inhibiting Factor,MIF)等多種抑制免疫功能的因子,分布于腫瘤組織的外圍或進(jìn)入血液循環(huán)中,對(duì)抗腫瘤免疫功能的抑制是多方面的和多過程參與的,最終將使機(jī)體免疫功能向Th2型免疫功能狀態(tài)漂移,以利于腫瘤的生長(zhǎng)[1,2]。所以腫瘤免疫治療很重要的一環(huán)就是要調(diào)節(jié)患者的抗腫瘤免疫功能,改善免疫抑制。

自由膨脹條件下，水分滲入膨潤(rùn)土中，最大程度楔開蒙脫石晶格間距，導(dǎo)致吸水后體積發(fā)生顯著的膨脹。當(dāng)干燥失水后，因毛細(xì)作用蒙脫石顆粒自身收縮，且團(tuán)(顆)粒之間也大幅靠近，從而引起顯著的收縮變形。由于納米氧化硅的充填效應(yīng)和氧化鈣的水化膠凝作用，摻入納米氧化硅和氧化鈣的膨潤(rùn)土收縮量明顯小于純膨潤(rùn)土。

試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和試驗(yàn)組共2個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)日糧配方相同（見表1），對(duì)照組所用飼料為錘片粉碎機(jī)工藝，試驗(yàn)組所用飼料為改進(jìn)后的對(duì)輥粉碎機(jī)工藝?；A(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

根據(jù)上述分析,對(duì)免疫治療應(yīng)該是免疫調(diào)節(jié)、非特異性免疫治療與特異性免疫治療并重,同時(shí)應(yīng)用。機(jī)體的非特異性抗腫瘤免疫主要由NK承擔(dān);特異性抗腫瘤免疫主要由活化的T淋巴細(xì)胞,通常為CTL承擔(dān)。CTL通過分子識(shí)別機(jī)制可以殺滅腫瘤細(xì)胞;即MHC限制性;但是有很多腫瘤細(xì)胞不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子(Ⅰ類或Ⅱ類)或異常表達(dá),所以那些不表達(dá)MHC分子或表達(dá)變異MHC分子的腫瘤細(xì)胞CTL無法識(shí)別和殺傷,但可由NK細(xì)胞殺滅。研究表明,NK細(xì)胞缺乏或活性低下時(shí),T細(xì)胞數(shù)量大幅下降,CTL功能低下,所以NK細(xì)胞功能的活化和增強(qiáng)對(duì)CTL的功能也有重要的調(diào)節(jié)作用。所以在腫瘤的免疫治療中,既要強(qiáng)調(diào)特異性,又不要忽視非特異的抗腫瘤免疫,針對(duì)腫瘤細(xì)胞MHC分子的這種表達(dá)狀況與NK、CTL的不同功能,同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用特異性和非特異性的免疫治療可獲得更好的治療效果,就如同化療采用細(xì)胞周期特異性和細(xì)胞周期非特異性藥物一樣。

在本研究中,我們以靈芝粉為基礎(chǔ)免疫調(diào)節(jié)藥物,其主要的功效成分為靈芝多糖和三萜類,可以增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)換,增加Th1型細(xì)胞因子的分泌,增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞的功能,恢復(fù)和增強(qiáng)整體免疫功能,在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中這些成分具有一定的肯定的功效。本研究證明在應(yīng)用靈芝粉的小鼠組,腫瘤有一定的縮小,IFN-γ和趨化因子9、10均有不同程度的升高。

在本研究中選用CpG-A為第二類制劑,以激活NK細(xì)胞。CpG-A除具有很強(qiáng)的活化NK細(xì)胞的活性,促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的成熟,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能外,也可促進(jìn)某些Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,如IFN-γ,而IFN-γ能促進(jìn)或上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC分子,這一作用對(duì)第三步的特異性免疫治療十分有益。研究證明CpG-A和靈芝粉與CpG-A的聯(lián)合應(yīng)用均可促進(jìn)IFN-γ、趨化因子9、10的產(chǎn)生,有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用,有利于改善腫瘤微環(huán)境,促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞和T細(xì)胞的功能。

上述二種免疫調(diào)節(jié)劑可以改善腫瘤宿主的免疫功能狀態(tài),改善腫瘤周邊微環(huán)境,促進(jìn)IFN-γ的升高,IFN-γ可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,抑制Th2型細(xì)胞因子的釋放和功能,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)MHC分子,有利于特異性免疫進(jìn)一步發(fā)揮作用。CpG具有明顯的促升IFN-γ的作用,局部應(yīng)用CpG有利于改善腫瘤周邊微環(huán)境,有利抗腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷,在聯(lián)合治療組中發(fā)現(xiàn),應(yīng)用靈芝和CpG后再應(yīng)用HSP70治療效果最好,細(xì)胞因子的升高也最明顯。對(duì)趨化因子CXCL-9、CXCL-10表達(dá)三種制劑均有一定的促進(jìn)作用,三種聯(lián)合效果最好。CXCL-9、CXCL-10可以抑制腫瘤新生血管的形成,抑制腫瘤生長(zhǎng),同時(shí)腫瘤新生血管減少,生長(zhǎng)緩慢還可以減少Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步減緩腫瘤免疫抑制,有利于Th1型細(xì)胞因子和效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。研究證明,這三種免疫制劑的聯(lián)合應(yīng)用是比較理想的腫瘤免疫治療方案,雖然CpG基序?qū)τ谡{(diào)節(jié)人類的抗腫瘤免疫尚不同于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[10,11],但是,根據(jù)這一原理,可以應(yīng)用針對(duì)活化人類NK細(xì)胞的免疫制劑進(jìn)行臨床應(yīng)用研究。

在聯(lián)合免疫治療組中,有三組小鼠的腫瘤最終消失,但腫瘤的消失速度以三種聯(lián)合應(yīng)用最快,證明本研究的設(shè)計(jì)符合對(duì)腫瘤免疫反應(yīng)的推測(cè),有必要進(jìn)行深入的研究。在靈芝粉與CpG的聯(lián)合治療組,腫瘤最終也消失,證明靈芝粉可以增強(qiáng)和調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能,而靈芝粉與HSP70的聯(lián)合治療組腫瘤沒有完全消失,CpG與HSP70的聯(lián)合免疫治療組腫瘤最終消失,證明NK細(xì)胞的功能活化對(duì)DC或CTL有重要的輔助作用,這對(duì)臨床應(yīng)用有重要的借鑒意義;所以,這三種免疫治療方法的聯(lián)合應(yīng)用并非簡(jiǎn)單地疊加,而是可以互相促進(jìn),作用相輔,按步驟應(yīng)用效果最好,已有研究表明CpG-A及HSP70誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫有記憶性效應(yīng),維持時(shí)間較長(zhǎng),而長(zhǎng)期應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)性中藥可以改善病人的免疫功能,很少有劑量限制性毒性,更有助于維持這種效應(yīng),所以更有利于控制腫瘤的復(fù)發(fā)。

我國(guó)的很多傳統(tǒng)扶正類中藥對(duì)調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫有較好的作用,應(yīng)用也十分廣泛,應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)方法制備NK細(xì)胞和CIK以及特異性的DC腫瘤疫苗也已經(jīng)進(jìn)入臨床研究,所以本研究對(duì)于如何科學(xué)地開展腫瘤免疫治療有一定的積極影響。

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