水稻鋅指蛋白基因OsZRL 過表達(dá)對根系發(fā)育的影響

玉曉紅，曾正明，苗雁文，牛向麗

（重慶大學(xué) 農(nóng)學(xué)及生命科學(xué)研究院，重慶400044）

在生物體中，轉(zhuǎn)錄因子通過與基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件特異結(jié)合而激活或抑制功能基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因的表達(dá)和機(jī)體功能。鋅指蛋白（zinc－finger protein）是轉(zhuǎn)錄因子中研究得比較深入的類型［1］，鋅指蛋白因其具有可以結(jié)合鋅離子的指狀結(jié)構(gòu)域－鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc－finger domain）而命名。根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域中半胱氮酸（C）和組氨酸（H）殘基的數(shù)目和位置可將鋅指蛋白分為C2H2、C2HC、C2C2等亞類。鋅指蛋白中有單個(gè)或成簇出現(xiàn)的鋅指結(jié)構(gòu)域，依賴在長期進(jìn)化過程中形成的鋅指結(jié)構(gòu)域的多變組合，使其不僅可以結(jié)合DNA，還可以結(jié)合RNA、蛋白質(zhì)和脂類底物，甚至同一類鋅指蛋白也顯示不同的結(jié)合特性。因此，鋅指蛋白具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重構(gòu)等多種生理功能［2］。

在植物中普遍存在鋅指蛋白，如在模式植物擬南芥基因組中預(yù)測有176個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因，這些鋅指蛋白通過基因復(fù)制（gene duplication）機(jī)制、進(jìn)化中變異而形成基因家族。有些鋅指蛋白是植物所特有的，可能與植物的特異生活方式密切相關(guān)［3～4］。鋅指蛋白廣泛參與植物各個(gè)時(shí)期的生長發(fā)育調(diào)控、脅迫應(yīng)答等［3，5～6］。如在玉米中鋅指蛋白ID1基因調(diào)控開花時(shí)間，水稻中同源基因RID1控制著水稻植株從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變［7～8］。但總體來說，在單子葉植物中相應(yīng)系統(tǒng)研究還較少，而生長發(fā)育調(diào)控基因及其分子機(jī)制的探討對于提高水稻等重要糧食作物產(chǎn)量、改善其田間農(nóng)藝性狀來說尤為重要。

本研究分離了一個(gè)水稻C2H2型鋅指蛋白基因，命名為 OsZRL （Zinc－finger Rootless）。通過構(gòu)建ZRL基因過量表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因水稻。轉(zhuǎn)基因植株表型顯示，鋅指蛋白基因OsZRL參與調(diào)控水稻的根系發(fā)育。

1 材料和方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 水稻材料

水稻粳稻品種日本晴（Oryza sative L．Nipponbare）種子由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2 菌株、質(zhì)粒和試劑

大腸桿菌（Escheriachia coli）DH5a，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，植物表達(dá)載體pHB由本實(shí)驗(yàn)室保存。植物RNA提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒購于北京天根生化有限公司。pEASY Blunt載體、高保真DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒Transgene公司。限制性內(nèi)切酶、Real－time PCR試劑盒購于TaKaRa公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TOYOBO公司。引物利用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。序列測定由北京華大基因科技有限公司完成。

1．2 方法

1．2．1 OsZRL基因擴(kuò)增與載體構(gòu)建

根據(jù)水稻OsZRL基因（Genebank登錄號(hào)：NM＿001062214）序列設(shè)計(jì)巢式引物擴(kuò)增OsZRL基因，分別為：外側(cè)引物 OsZRLF1：5＇CGTCGGCATAAAGCAGTCTC 3＇，OsZRLR1：5＇GCTGCTTCACTGCCTTTAGC 3＇；內(nèi)側(cè)引物 OsZRLF2：5＇AAGCTTCGAGCTGAAGTAGGGATGG 3＇，OsZRLR2：5＇GAGCTCTTGCATTTTGTGTGGGTGTG 3＇（下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Hind III、Sac I）。按照植物RNA提取試劑盒說明從水稻品種日本晴葉片中提取總RNA，取1μg合成第一鏈cDNA。第一輪PCR條件為：98℃2min，98℃10s，56℃10s，72℃80s，30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5min。第二輪PCR條件為：98℃2min，98℃10s，58℃10s，72℃75s，30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測、膠回收后連接于pEASY Blunt載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞、鑒定陽性克隆并送測序。

測序正確的OsZRL基因經(jīng)HindIII、SacI雙酶切、膠回收后連接于植物表達(dá)載體pHB。經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定獲得35S：：OsZRL載體，命名為pHB－OsZRL。然后利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并鑒定陽性轉(zhuǎn)化菌，用于侵染水稻愈傷組織。

1．2．2 OsZRL基因生物信息學(xué)分析

通 過 BLAST （http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／）尋找OsZRL基因在擬南芥中的同源基因，并通過DNAMAN軟件進(jìn)行比對。利用SMART 軟 件 （http：／／smart．embl － heidelberg．de／）預(yù)測OsZRL基因的功能結(jié)構(gòu)域。

1．2．3 OsZRL基因過表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化

本實(shí)驗(yàn)水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。將日本晴成熟種子去殼得到成熟胚，分別于75%乙醇（v／v）、25%次氯酸鈉溶液（v／v）消毒1min、25 min后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基。連續(xù)間隔14d繼代2次后進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染，共培養(yǎng)2d后去除農(nóng)桿菌。在含有潮霉素的培養(yǎng)基中篩選抗性愈傷，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，分化后移至生根培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：NB ＋ 2mg·L－12，4－D，pH 5．8～5．9；共培養(yǎng)培養(yǎng)基：NB＋2mg·L－12，4－D＋100μmol·L－1乙酰丁香酮，pH 5．2；篩選培養(yǎng)基：NB＋2mg·L－12，4－D ＋250mg·L－1羧芐青霉素 ＋30～50mg·L－1潮霉素，pH 5．8～5．9；分化培養(yǎng)基：NB ＋ 10mg·L－1KT ＋ 0．4 mg·L－1NAA ＋250mg·L－1羧芐青霉素，pH 5．8～5．9；生根培養(yǎng)基：1／2MS，pH 5．8～5．9。

1．2．4 OsZRL基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型分析

將轉(zhuǎn)基因分化小苗從生根培養(yǎng)基移至土壤中生長，進(jìn)行表型觀察。提取野生型、轉(zhuǎn)基因小苗基因組DNA，利用載體所帶潮霉素抗性標(biāo)記基因Hpt序列（Genebank登錄號(hào)：E00777），進(jìn)行PCR檢測鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。擴(kuò)增引物分別為HPTF：5＇TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG 3＇，HPTR：5＇GCGTCTGCTGCTCCATACAAG 3＇。提取野生型、轉(zhuǎn)基因陽性植株RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR（RT－PCR）檢測OsZRL基因表達(dá)水平。以ACTIN（Genebank登錄號(hào)：X16280）做為內(nèi)參基因。所用 ACTIN 引物為：RTACTF：5＇AGTGATTGCACCACCAGAAAGA 3＇，RTACTR：5＇CAGGACCAGATTCATCATACTCG 3＇；OsZRL引物為：RTZRLF：5＇GGATGAAGAAGACGATGATGACG 3＇，RTZRLR：5＇CGATCCCTCGCTATGTACTTGC 3＇。RT－PCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5s，60℃20s，40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，樣品在95℃保持15s，60℃保持1min。后每15s上升0．5℃進(jìn)行溶解曲線分析。每個(gè)樣品重復(fù)三次。PCR 反 應(yīng) 在 Applied Biosystems Step－One RTPCR system上運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2．1 OsZRL基因克隆與載體構(gòu)建

利用野生型水稻品種日本晴葉片cDNA擴(kuò)增OsZRL基因，第二輪PCR產(chǎn)物得到預(yù)期片段（1283bp，圖1A）。將PCR產(chǎn)物連接于pEASY Blunt載體，陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)比對確認(rèn)為水稻OsZRL基因全長編碼序列。分別用HindIII、Sac I雙酶切測序pEASY Blunt載體和pHB植物表達(dá)載體，連接、轉(zhuǎn)化后獲得過表達(dá)載體pHB－OsZRL。酶切結(jié)果顯示所得片段與預(yù)期相符，表明OsZRL基因過表達(dá)載體構(gòu)建正確（圖1B，C）。提取pHB－OsZRL質(zhì)粒，凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105用于侵染。

圖1 OsZRL基因過量表達(dá)載體構(gòu)建Fig．1 Construction of OsZRLoverexpression vector

2．2 OsZRL基因生物信息學(xué)分析

利用SMART軟件對OsZRL基因編碼序列功能域進(jìn)行分析，在第211～233位氨基酸有一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，第298～320位氨基酸有一個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)域（圖2）。序列比對表明，OsZRL基因與擬南芥中一個(gè)未知功能的鋅指蛋白At1g08290有較高同源性，在鋅指結(jié)構(gòu)域有很高保守性（圖2）。因此，推測OsZPL基因?yàn)橐坏湫偷匿\指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，可能在水稻中具有基因表達(dá)及發(fā)育調(diào)控作用。

2．3 轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入野生型水稻品種日本晴，共獲得35株獨(dú)立轉(zhuǎn)基因陽性分化植株，其中共有7株轉(zhuǎn)基因小苗因根系不能正常發(fā)育，將轉(zhuǎn)基因植株OX－1～OX－4移入土壤生長約一周后萎蔫死亡（圖3A，B）。OX－5～OX－7持續(xù)在封閉培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，雖然有較多幼莖、葉發(fā)育，但由于始終只有極少根系發(fā)育，影響植株地上部分生長，莖葉褪綠發(fā)白，部分開始萎蔫死亡（圖3C）。

圖2 水稻OsZRL基因與擬南芥同源基因的氨基酸序列比對Fig．2 The amino sequence alignment between rice OsZRLand its homologous genes in Arabidopsis

圖3 轉(zhuǎn)基因植株表型Fig．3 Phenotype of transgenic plants

2．4 轉(zhuǎn)基因植株鑒定與OsZRL基因表達(dá)量檢測

提取轉(zhuǎn)基因、野生型水稻葉片DNA，用于潮霉素抗性標(biāo)記基因Hpt序列PCR擴(kuò)增檢測。陽性植株擴(kuò)增出Hpt目標(biāo)條帶（560bp），而野生型植株未能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖4）。檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因根系不發(fā)育植株（OX－5～OX－7）、根系發(fā)育正常植株（OX－8、OX－9）均為陽性植株。

圖4 OsZRL轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定Fig．4 PCR analysis of OsZRLtransgenic plants

提取野生型水稻、5個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性植株（OX－5～OX－9）葉片RNA，采用RT－PCR法，分析轉(zhuǎn)基因植株中OsZRL的表達(dá)情況。結(jié)果表明，3個(gè)根系不發(fā)育植株（OX－5～OX－7）中OsZRL基因較根系發(fā)育正常植株（OX－8、OX－9）及野生型顯著提高（圖5），初步表明OsZRL基因參與調(diào)控水稻根系生長發(fā)育。

圖5 OsZRL轉(zhuǎn)基因植株real－time RT－PCR分析Fig．5 Real－time RT－PCR analysis of expression levels of OsZRLin transgenic plants

3 討論

盡管對植物鋅指蛋白的研究工作已經(jīng)進(jìn)行了20多年，但是大部分被克隆的基因多局限于雙子葉植物，對單子葉植物中鋅指蛋白的研究還相對偏少［9］。本研究通過從水稻品種日本晴中克隆了一個(gè)具有鋅指結(jié)構(gòu)域的基因OsZRL，并構(gòu)建過表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化野生型水稻對其功能進(jìn)行初步分析，轉(zhuǎn)基因植株表型分析結(jié)果表明鋅指蛋白基因OsZRL參與調(diào)控水稻根系發(fā)育。

水稻根系是吸收水分、礦物質(zhì)和感受土壤環(huán)境的橋梁，又是氨基酸、多種激素同化、合成的場所，根系狀況直接影響著植株地上部分生長發(fā)育及產(chǎn)量的形成，是制約水稻產(chǎn)量潛力進(jìn)一步發(fā)揮的關(guān)鍵因素。但由于植物根系隱藏于地下，其發(fā)育的形態(tài)和生理學(xué)觀察不易進(jìn)行，相應(yīng)分子機(jī)制的研究也較其他植物器官滯后。雖然，近年在雙子葉模式植物擬南芥根的發(fā)育方面有了比較大的進(jìn)展［10］，但由于單、雙子葉植物根系的不同，如在擬南芥中有主根，然后順序分生出側(cè)根，而水稻、玉米等則是形成龐大而復(fù)雜的不定根系［11～12］。所以，谷類作物還沒有一套具體的根系形態(tài)、生理特征改良指標(biāo)，對根系發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制也所知甚少。

在已知的水稻根發(fā)育相關(guān)基因研究中，CRL1（CROWN ROOTLESS 1）和 WOX11（WUSCHEL－related homeobox gene）基因分別通過介導(dǎo)生長素信號(hào)傳導(dǎo)或生長素／細(xì)胞分裂素信號(hào)整合調(diào)控水稻不定根的生長發(fā)育［13～14］；OsRMC基因通過茉莉酸信號(hào)途徑促進(jìn)水稻根的發(fā)育、彎曲和卷曲［15］；另一類basic helix－loop－h(huán)elix（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子基因RSL4（ROOT HAIR DEFECTIVE6－LIKE4）也控制著根部細(xì)胞生長的大小［16］。本研究通過轉(zhuǎn)基因方法對鋅指蛋白基因OsZRL功能的分析，為水稻根系發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制的探討提供了基礎(chǔ)與新的線索。

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