地膚子活性成分對(duì)山楂葉螨酯酶同工酶的影響

張慧榮，劉素琪，王海香，郝曉娟，莫海波，曹揮

（1．太原市園林局，山西 太原030001；2．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；3．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷030801）

酯酶（esterase，EST）是生物體內(nèi)一類重要的解毒酶系，其活性的變化會(huì)直接影響昆蟲對(duì)殺蟲劑中毒和解毒過程［1］。高希武等曾對(duì)蚜蟲（Aphisgossypii）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）、小菜蛾（Plutellamaculipennis）等昆蟲進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥和植物次生性物質(zhì)通過對(duì)昆蟲體內(nèi)羧酸酯酶的抑制，在一定程度上抑制了昆蟲體內(nèi)的解毒代謝［2～4］，了解酯酶活性的變化規(guī)律在殺蟲藥劑和昆蟲（螨類）解毒代謝間關(guān)系的研究中具有重要意義。

山楂葉螨（Tetranychus Viennensis Zacher．）個(gè)體小，繁殖快，種群密度高，為害重，是危害果樹生產(chǎn)的主要害螨之一。目前噴施化學(xué)農(nóng)藥是有效防治山楂葉螨的主要手段，由于其世代繁殖頻繁和世代重疊嚴(yán)重，一年中用藥次數(shù)明顯高于其它害蟲的防治，并且在用藥過程中往往是單一品種的大量重復(fù)使用，導(dǎo)致其抗藥性逐年增加，防治費(fèi)用也是逐年加大。

地膚Kochia Scoparia （L．）Schrad．，俗名掃帚菜，掃帚苗，屬藜科地膚屬一年生草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)野菜，也是一種傳統(tǒng)的中藥材［5］。地膚提取物有很好的殺螨活性［6～8］。地膚主要以其子入藥，因此我們以地膚子為材料，對(duì)其活性成分進(jìn)行分離，并研究了其活性成分對(duì)山楂葉螨體內(nèi)的酯酶的影響，旨在探索地膚子活性成分對(duì)螨類的影響，為新型植物性殺螨劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

試驗(yàn)所用地膚子采自山西農(nóng)大校園內(nèi)（10月初），將植物材料洗凈后在室內(nèi)陰干（約25℃），放入恒溫箱內(nèi)（40～45℃）烘干，磨碎，過60目篩，放入冰箱中儲(chǔ)藏備用。

山楂葉螨為室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感品系：養(yǎng)蟲室的溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（50±10）%，光照（L∶D為18h∶6h）。

1．2 地膚子活性成份的分離

將植物干粉加入5倍量的氯仿，室溫下（25±2）℃浸提3次，每次3～5d，過濾，合并3次的提取液減壓濃縮，得氯仿提取物（KFCE）。

稱取KFCE 10g，采用常壓開管柱層析法進(jìn)行柱層析分離。洗脫后的流分經(jīng)檢測(cè)合并，得到11個(gè)流分，其中以流份2殺螨活性最高，將其減壓濃縮至稠狀得KFCE－2。

將KFCE－2用少量氯仿充分溶解，再用水稀釋成濃度為1g·L－1的藥液作為處理藥劑。

1．3 癥狀觀察

用葉片浸漬法處理試螨，每隔2h觀察其中毒癥狀的表現(xiàn)。

葉片浸漬法（Leaf disk dip method）在9cm的培養(yǎng)皿中放入大小一致的吸水海綿，海綿上平鋪一層吸水紙，摘取平展的蘋果葉，洗凈，葉面朝下平貼在吸水紙上，每一葉片挑入成螨，待成螨穩(wěn)定后，剔除死亡和受傷個(gè)體，保證葉片有成螨30頭，用鑷子夾取葉片浸藥液5s，吸去多余藥液。再平鋪于葉片上置于養(yǎng)蟲室內(nèi)。

1．4 酯酶同工酶電泳

酶液制備：分別在用藥劑、清水對(duì)照（用喉頭噴霧器噴霧）處理后4h、8h、12h、16h、20h、24h取山楂葉螨雌成螨100頭，加0．25mL生理鹽水冰浴中勻漿后，10 000r·min－1，4℃下離心15min，取上清液備用。另設(shè)一個(gè)不做任何處理的新鮮螨對(duì)照。

采用不連續(xù)的垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳［9］：分離膠濃度7．5%，pH 8．9；濃縮膠濃度3．3%，pH 6．7；Tris－甘氨酸高離子濃度電極緩沖液，pH 8．3；上樣量80μL，溴酚蘭作前沿指示。預(yù)電泳電流為20 mA·板－1，樣品進(jìn)入分離膠后電流增至40mA·板－1，6℃穩(wěn)流電泳4h。

酯酶同工酶染色液以pH 6．4磷酸緩沖液配制。內(nèi)含底物 0．05% 醋酸－α－萘 酯 （70% 丙 酮溶解）、0．1%醋酸－β－萘酯（100%丙酮溶解）以及染色劑1%堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽，37℃染色約10min。染色完畢后膠板以7%醋酸固定，電泳圖在UVP－凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 FCE－2癥狀觀察

KFCE－2對(duì)山楂葉螨雌成螨的中毒作用大致可劃分為以下幾個(gè)階段：

（1）靜止期（0～4h）：少數(shù)螨不停地運(yùn)動(dòng)，但大部分靜止，足呈伸展放松狀態(tài)，無明顯反應(yīng)；

（2）興奮期（4～8h）：站立不穩(wěn)，頻繁爬動(dòng)，步態(tài)失調(diào)，運(yùn)動(dòng)不停，四處擴(kuò)散；

（3）痙攣期（8～16h）：過度興奮，身體傾斜，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，原地打轉(zhuǎn)，身體重心抬高，足顫抖，有黑色排泄物，產(chǎn)卵量急劇下降；

（4）死亡期（16～24h）：身體逐漸收縮至死亡。

KFCE－2處理成螨后，先是靜止不動(dòng)，經(jīng)過短暫地興奮后，蟲體大量進(jìn)入麻痹期，經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)8個(gè)小時(shí)的麻痹期后，進(jìn)入死亡期，而且產(chǎn)卵量急劇下降，蛻皮大量減少，有黑色排泄物。

2．2 KFCE－2對(duì)山楂葉螨體內(nèi)酯酶同工酶電泳結(jié)果

KFCE－2對(duì)山楂葉螨酯酶同工酶作用后的凝膠電泳圖譜見圖1。

KFCE－2處理山楂葉螨后，在對(duì)照組的凝膠電泳圖上可明顯地看到3條酯酶酶帶：E1、E2、E3，處理組的凝膠電泳圖上可明顯地看到2條酯酶酶帶：E1、E2，而E3只在處理的4～8h可以看到，12h后消失。從對(duì)照組與處理組的酶帶變化的情況來看，E1、E2的變化主要表現(xiàn)在顏色的深淺和面積的大小上，處理組的這兩條酶帶比對(duì)照組的顏色要淺，而且圖譜面積小，尤其在處理的16h后，這種直觀效果更為明顯；而E3在顏色深淺和面積大小上的變化還要清晰，在處理組的4h～8h，E3的面積就急劇地減少，但仍能觀察到，12h后，E3完全消失。此外，在處理組中，沒有檢測(cè)到新的其它酶帶。這表明了KFCE－2處理山楂葉螨后，強(qiáng)烈地抑制了其體內(nèi)酯酶的活性，解毒作用減弱，導(dǎo)致有毒物質(zhì)在其體內(nèi)的積累，引起中毒。

圖1 KFCE－2對(duì)山楂葉螨酯酶同工酶活性的影響Fig．1 Effects of KFCE－2on esterase isoenzyme

2．3 酯酶同工酶UPV－凝膠成像系統(tǒng)掃描結(jié)果分析

酯酶同工酶電泳圖譜經(jīng)UVP2凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果見圖2和表1，可以看出：未經(jīng)KFCE－2處理的山楂葉螨的掃描分析均可清楚檢測(cè)到E1、E2、E3條酯酶同工酶帶。經(jīng)KFCE－2處理山楂葉螨的掃描分析均可檢測(cè)到E1、E2帶，但E2帶在處理的12h后就檢測(cè)不到了。

表1 KFCE－2對(duì)山楂葉螨酯酶同工酶活性掃描分析數(shù)據(jù)Fig．1 The datas of scan of KFCE－2on esterase isoenzyme

圖2 KFCE－2對(duì)山楂葉螨酯酶同工酶活性掃描分析結(jié)果Fig．2 The results of scan of KFCE－2on esterase isoenzyme

從觀察到的3條酶帶的強(qiáng)度變化可以看出，與對(duì)照組相比，E1帶的活性在KFCE－2處理后的4h（LANE－a＇）有所激活，螨體加強(qiáng) 了解毒 代謝，8h（LANE－b＇）、12h（LANE－c＇）的活性變化不大，但從16h開始到24h（LANE－d＇～ LANE－f＇），其活性逐漸減弱，活性受到抑制。E2、E3帶的活性從處理的4h（LANE－a＇）開始活性就在逐漸減弱，尤其是 E3帶的活性在處理的12h后（LANE－c＇）就完全被抑制。

在遷移率的變化上，處理組與對(duì)照組相比，在相同的處理時(shí)間，處理組E1、E2帶的遷移率有逐漸增大的趨勢(shì)，尤其在處理的20h（LANE－e＇）和24 h（LANE－f＇），表現(xiàn)更為明顯；E3帶的遷移率在能觀察到的兩個(gè)時(shí)間內(nèi)，有減小的趨勢(shì)。譜帶的遷移距離與相應(yīng)酶的分子質(zhì)量呈正相關(guān)，因此處理組與對(duì)照組相比，E1、E2帶對(duì)應(yīng)的同工酶分子質(zhì)量變小，而E3帶對(duì)應(yīng)的同工酶分子質(zhì)量變大，酶分子結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變。

3 結(jié)論與討論

酯酶普遍存在于生物體內(nèi)，在對(duì)許多種昆蟲的研究中證明其在殺蟲藥劑代謝中起重要作用，當(dāng)外源有害物質(zhì)進(jìn)入生物體內(nèi)時(shí)，它會(huì)以水解蛋白和結(jié)合蛋白兩種方式積極參與解毒代謝。同時(shí)酯酶具有廣泛的底物專一性和重疊性，在殺蟲藥劑代謝中不需要額外能量即可催化酯類化合物水解，這種高效的解毒代謝體系在生物體與外界不良環(huán)境因子的斗爭(zhēng)過程中很可能發(fā)揮重要作用［10～11］。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，KFCE－2處理山楂葉螨后，其酯酶同工酶的活性受到了不同程度的抑制，并且出現(xiàn)了E3酶帶的消失，這表明KFCE－2可能通過抑制山楂葉螨體內(nèi)的酯酶同工酶的活性，并且通過特異性的結(jié)合，改變部分酯酶的活性結(jié)構(gòu)，來降低其解毒代謝，導(dǎo)致其中毒，最終死亡。

為了更好地了解KFCE－2對(duì)山楂葉螨的影響，我們對(duì)藥劑處理后試螨的癥狀進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)其中毒過程可分為四個(gè)時(shí)期：靜止期（0～4h）：少數(shù)螨不停地運(yùn)動(dòng)，但大部分靜止，足呈伸展放松狀態(tài)，無明顯反應(yīng)；興奮期（4～8h）：站立不穩(wěn)，頻繁爬動(dòng)，步態(tài)失調(diào)，運(yùn)動(dòng)不停，四處擴(kuò)散；痙攣期（8～16 h）：過度興奮，身體傾斜，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，原地打轉(zhuǎn)，身體重心抬高，足顫抖，有黑色排泄物，產(chǎn)卵量急劇下降；死亡期（16～24h）：身體逐漸收縮至死亡。

從酯酶同工酶電泳結(jié)果和藥劑處理后試螨的中毒癥狀結(jié)果可以看出，試螨進(jìn)入痙攣期的時(shí)間正好是其體內(nèi)的E3帶消失的時(shí)間，而引起痙攣的主要原因可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突傳導(dǎo)被阻斷，周緣神經(jīng)正常突觸傳遞受阻嚴(yán)重［12］。酯酶的種類很多，乙酰膽堿酯酶是其中重要的一類，它主要存在于中樞神經(jīng)灰質(zhì)、交感神經(jīng)節(jié)等處，能夠迅速水解興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿而保持神經(jīng)突觸傳遞的正常功能，KFCE－2處理山楂葉螨后，其活性可能會(huì)被抑制，而它的被抑制會(huì)引起膽堿在突觸處的積累，從而導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)阻斷，而消失的E3帶是否就是乙酰膽堿酯酶，仍需進(jìn)一步研究。

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