文冠果DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化

高曉欣，張蕓香，郭晉平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷030801）

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）又名木瓜，屬無患子科文冠果屬，小喬木，是我國特有木本油料樹種，制藥原料樹種、優(yōu)良觀賞樹種和特殊用材樹種［1，2］，隨著生物能源的發(fā)展，文冠果果實(shí)作為生物柴油原料利用己引起廣泛關(guān)注。自20世紀(jì)80年代以來，我國就開展了對文冠果的研究，但多集中于文冠果的栽培管理、育種繁殖和群落特征等方面，而在分子水平上對其進(jìn)行系統(tǒng)研究的報(bào)道甚少。

在研究過程中發(fā)現(xiàn)，文冠果存在的最大問題是座果率和結(jié)果率低，素有“千花一果”之說［3］，這成為制約其推廣的關(guān)鍵問題。因此，文冠果良種選育就成為亟待解決的問題，而遺傳多樣性豐富的種質(zhì)資源是良種選育的前提?！笆の濉逼陂g，中國林科院對我國文冠果資源進(jìn)行了詳細(xì)調(diào)查，結(jié)果顯示，在華北、華東及西北地區(qū)均有豐富的文冠果資源，其中黃土高原是文冠果集中分布區(qū)。不同區(qū)域的氣候差異和植物對生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)性，增加了文冠果的遺傳多樣性。采用RAPD技術(shù)開展文冠果遺傳多樣性的研究，將為文冠果良種選育提供技術(shù)支撐，對于其它木本油料植物研究也有借鑒意義，也為今后采用生物技術(shù)、基因工程技術(shù)等手段對文冠果種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（簡稱RAPD）技術(shù)從遺傳物質(zhì)DNA水平上揭示種質(zhì)之間的遺傳變異情況［4～5］，自問世以來，在短短幾年內(nèi)已廣泛應(yīng)用于基因定位、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定以及起源、演化和分類等諸多領(lǐng)域，成為當(dāng)今最重要的分子生物技術(shù)之一。但RAPD技術(shù)易受DNA模板純度、試劑濃度、反應(yīng)條件、操作技術(shù)水平等諸多因素的影響，擴(kuò)增的特異性和可重復(fù)性較差，但在高度重復(fù)的RAPD反應(yīng)條件下，同一樣品在不同重復(fù)和計(jì)數(shù)間的誤差頻率可控制在3%以下［6］。因此，本試驗(yàn)以文冠果基因組DNA為材料，建立了適合于文冠果的RAPD最佳反應(yīng)體系，旨在為更好地利用RAPD技術(shù)對文冠果進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 優(yōu)良單株選擇與材料采集

1．1 優(yōu)良單株選擇

通過查閱山西文冠果的主要自然分布區(qū)，確定從南到北在20個(gè)縣進(jìn)行野外優(yōu)樹選擇，通過實(shí)地調(diào)查選擇優(yōu)良單株，共獲得20個(gè)優(yōu)良單株，見表1。

表1 采集的文冠果材料Table 1 The Xanthoceras sorbifolia Bunge materials

1．2 材料采集

為了獲得每個(gè)優(yōu)良單株的繁殖材料和提取DNA的材料，盡量采集其種子，對沒有種子的單株挖取其完好根段進(jìn)行保濕處理，在低溫保溫箱內(nèi)包裝，并采集健康幼葉，立即用硅膠保存，一并帶回實(shí)驗(yàn)室。將收集的根段分小區(qū)種植在苗圃中進(jìn)行埋根繁殖以保存種源，發(fā)芽成苗后為后續(xù)提取DNA準(zhǔn)備材料。將收集的種子一部分用于提取DNA，一部分在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽處理，長出的嫩葉用于提取DNA，收集回來的葉片亦用于提取DNA。這樣每個(gè)單株都采集了幼葉、種子發(fā)芽苗或根孽苗作為提取DNA的材料。

2 結(jié)果與分析

2．1 文冠果RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化

2．1．1 文冠果基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取文冠果基因組DNA。采用0．8%的瓊脂糖（含EB即溴化乙錠）凝膠電泳方法檢測DNA樣品。以DNA Marker（λDNA cut with HindⅢ＋EcoRⅠ）為標(biāo)量，以1×TAE作電泳緩沖液，在0．8%的瓊脂糖凝膠上電泳。用凝膠成像分析儀采集圖像，以檢測樣品DNA的質(zhì)量和分子量大小。通過紫外分光光度儀測定DNA的純度。

2．1．2 DNA提取結(jié)果

DNA的提取和純化是進(jìn)行RAPD擴(kuò)增的首要條件，DNA質(zhì)量的好壞直接影響實(shí)驗(yàn)的成敗。由圖1可知，所得DNA樣品的主譜帶清晰，遷移率低，排列整齊，完整性較好，無明顯降解現(xiàn)象，無RNA帶，點(diǎn)樣孔內(nèi)無滯留；其OD260／OD280之值均在1．6～1．9之間，說明DNA質(zhì)量和純度均可以滿足RAPD分析的要求。

圖1 文冠果材料DNA檢測圖譜Fig．1 DNA test patternof every Xanthoceras sorbifolia material

2．2 文冠果RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化

本研究采用單因素設(shè)計(jì)方法對文冠果RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。其中Mg2＋濃度梯度設(shè)置為1．5mmol·L－1、2mmol·L－1、3mmol·L－1、4 mmol·L－1、5mmol·L－1和 6mmol·L－1；dNTPs的濃度梯度設(shè)置為80μmol·L－1、100 μmol·L－1、120μmol·L－1、160μmol·L－1、200 μmol·L－1、240μmol·L－1；模板DNA濃度梯度設(shè)置為20ng、30ng、40ng、50ng和60ng；Taq酶濃度梯度設(shè)置為0．00U、0．75U、1．00U、1．25 U、1．50U、1．75U；退火溫度梯度設(shè)置為34．9℃、36．9℃、38．9℃、40．9℃；循環(huán)次數(shù)47、45、43、41等4個(gè)梯度。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性120s，94℃變性30s，36．9℃退火45s，72℃延伸90s，45個(gè)循環(huán)后在72℃延伸300s，結(jié)束后在4℃條件下保存。

2．3 RAPD反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2．3．1 Mg2＋濃度對PCR結(jié)果的影響

由圖2可以看出，Mg2＋濃度對PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率均有影響。當(dāng) Mg2＋濃度為1．5 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增譜帶不完全，擴(kuò)增的強(qiáng)度不大，說明擴(kuò)增的DNA片斷量較小。當(dāng)Mg2＋濃度為2 mmol·L－1、3mmol·L－1和4mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增的效果好，條帶亮度較好，擴(kuò)增完全，無拖尾和彌散現(xiàn)象；當(dāng) Mg2＋濃度為5mmol·L－1和6mmol·L－1時(shí)，出現(xiàn)了彌散，擴(kuò)增譜帶不完全。可見，對于文冠果來說，Mg2＋濃度應(yīng)在2～4mmol·L－1。本研究最終選擇2mmol·L－1作為RAPD擴(kuò)增最佳參數(shù)。

圖2 Mg2＋濃度對RAPD擴(kuò)增的影響Fig．2 Effort of Mg2＋ concentration on RAPD Amplification

2．3．2 dNTPs濃度對PCR結(jié)果的影響

dNTPs的濃度也是反應(yīng)體系中的一個(gè)關(guān)鍵因素，dNTPs的用量與PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物的忠實(shí)性有關(guān)。從圖3的PCR擴(kuò)增圖中可以看出，六個(gè)濃度均能擴(kuò)增出清晰條帶。但是當(dāng)dNTPs濃度為80 μmol·L－1，有些條帶不能擴(kuò)增。其余濃度擴(kuò)增完全，譜帶清晰。本實(shí)驗(yàn)采用100μmol·L－1作為RAPD分析的dNTPs濃度。

圖3 dNTPs濃度對RAPD擴(kuò)增的影響Fig．3 Effort of dNTPs concentration on RAPD Amplification

2．3．3 模板DNA用量對PCR結(jié)果的影響

從圖4的PCR擴(kuò)增圖中可以看出，在五個(gè)梯度范圍內(nèi)均能得到擴(kuò)增譜帶。但當(dāng)DNA濃度為20ng時(shí)，條帶擴(kuò)增不完全，說明DNA模板濃度過低可能造成擴(kuò)增帶強(qiáng)度不夠或擴(kuò)不出條帶；在30 ng、40ng、50ng和60ng濃度條件下擴(kuò)增的效果較好，條帶清晰、穩(wěn)定一致的譜帶，且重復(fù)性好。因此本實(shí)驗(yàn)采用30ng的模板DNA濃度。

2．3．4 TaqDNA聚合酶對PCR結(jié)果的影響

從圖5的擴(kuò)增圖譜可以看出：6個(gè)酶濃度對擴(kuò)增的結(jié)果是有影響的。當(dāng)酶濃度為0．5和0．75U時(shí)，擴(kuò)增的條帶不完全，當(dāng)為1．00U、1．25U、1．50 U、1．75U時(shí)均能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定和均一的條帶，說明當(dāng)Taq酶濃度為1U時(shí)就能滿足擴(kuò)增的需要，實(shí)踐中可選擇1U的Taq酶濃度作為擴(kuò)增參數(shù)。

圖4 DNA濃度對RAPD擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig．4 Effort of template concentration on RAPD Amplification

圖5 TaqDNA聚合酶濃度對RAPD擴(kuò)增的影響Fig．5 Effort of TaqDNA polymerase concentration on RAPD Amplification

2．3．5 循環(huán)次數(shù)與退火溫度對RAPD反應(yīng)的影響

在其它條件一致的情況下，由圖6可以看出，退火溫度過高或過低擴(kuò)增非特異性條帶就少，循環(huán)次數(shù)越多擴(kuò)增產(chǎn)物的量越多，不利于對結(jié)果的統(tǒng)計(jì)。36．9℃的退火溫度與45個(gè)循環(huán)次數(shù)時(shí)擴(kuò)增的帶數(shù)適中，且?guī)颓逦?、穩(wěn)定，可以有效地檢測多態(tài)性。

圖6 循環(huán)次數(shù)和退火溫度對RAPD擴(kuò)增的影響Fig．6 Influence to RAPD by cycles and annealing temperature

2．4 優(yōu)化反應(yīng)體系的擴(kuò)增效果

根據(jù)上述各實(shí)驗(yàn)得出的反應(yīng)體系最佳濃度值，對表1中的20個(gè)文冠果材料進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為OPE－18。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠（含0．5mg·L－1EB）上電泳，以DNA Marker 2000指示DNA譜帶分子量的大小。電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察拍照，所得擴(kuò)增條帶見圖7。由圖7可見，擴(kuò)增條帶清晰，并具有很好的多態(tài)性和重復(fù)性，能滿足文冠果遺傳變異研究的需要。本研究所獲得的優(yōu)化反應(yīng)體系適于文冠果的RAPD分析。

圖7 引物OPE－18擴(kuò)增結(jié)果Fig．7 Amplification Result of OPE－18Primer

3 討論與結(jié)論

3．1 討論

不同材料，不同實(shí)驗(yàn)方法，所需要的擴(kuò)增條件也不一樣，會對RAPD的圖譜產(chǎn)生很大的影響，從而影響RAPD分析的準(zhǔn)確性，而RAPD圖譜的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性是利用RAPD標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析的前提條件，因此有必要對RAPD進(jìn)行優(yōu)化。

高質(zhì)量的DNA模板是保證RAPD反應(yīng)順利、穩(wěn)定進(jìn)行的前提條件，模板濃度在一定范圍內(nèi)對擴(kuò)增結(jié)果影響較小，純度對擴(kuò)增的特異性影響很大。該研究結(jié)果表明，采用常規(guī)CTAB抽提法獲得的DNA完全能夠滿足RAPD分析的要求。

混合物中的離子濃度，尤其是 Mg2＋濃度對RAPD的特異性及擴(kuò)增效率有很大的影響。該試驗(yàn)和有關(guān)資料均表明［7～8］，Mg2＋濃度過高或過低均會影響擴(kuò)增結(jié)果。Mg2＋是Taq酶的激活劑，Mg2＋濃度過低，對Taq酶的活化作用不夠，過高又會抑制該酶的活性。Mg2＋除直接影響PCR的特異性和效率外，還有利于引物和模板的結(jié)合及增加引物和模板結(jié)合后的穩(wěn)定性，這對于使用非特異性引物的RAPD反應(yīng)來講，Mg2＋顯得更重要。但是反應(yīng)體系中所示Mg2＋濃度并不一定是參加反應(yīng)的游離Mg2＋濃度，因?yàn)榉磻?yīng)體系中DNA模板的濃度、純度、引物、dNTP均會影響 Mg2＋濃度。該試驗(yàn)中Mg2＋的最適濃度為2mmol·L－1。

dNTPs是作為RAPD擴(kuò)增的反應(yīng)底物，它的用量直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的多少、擴(kuò)增特異性的高低以及合成的忠實(shí)性。dNTPs濃度過低會影響合成效率，直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，甚至?xí)騞NTPs過早耗盡而使產(chǎn)物單鏈化而影響擴(kuò)增效果；dNTPs濃度過高，容易與Mg2＋結(jié)合，降低Mg2＋濃度，抑制Taq酶活性，會使核苷酸錯(cuò)誤摻入，引起堿基的錯(cuò)配，產(chǎn)生新的條帶。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，dNTPs對文冠果RAPD擴(kuò)增效果的影響不大。這與苦瓜［9］、思茅松［10］、枸杞［11］等物種進(jìn)行RAPD分析時(shí)，dNTPs的濃度對擴(kuò)增效果影響不大結(jié)論一致。

DNA模板適宜的范圍較大，一般而言模板DNA在5～100ng均有RAPD產(chǎn)物，但不同物種DNA結(jié)構(gòu)不同，具體的最適DNA用量也有差異［12］。本試驗(yàn)中所采用的的濃度梯度中，均可以擴(kuò)增出理想的結(jié)果，但考慮到降低錯(cuò)誤的摻入率，減少假陽性條帶的出現(xiàn)，試驗(yàn)最終確定30ng的模板DNA為最適宜的濃度。

Taq酶的活性與用量是關(guān)系到擴(kuò)增能否正常進(jìn)行的重要因子，不同的生產(chǎn)廠家對酶濃度的標(biāo)定可能不同，因此在實(shí)驗(yàn)的過程中，應(yīng)針對所用的Taq酶確定用量。Taq酶濃度過低導(dǎo)致效率降低，延伸不完全，擴(kuò)增產(chǎn)物減少；使用高濃度的Taq酶，不僅造成經(jīng)濟(jì)上的浪費(fèi)，而且容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［13］。在該試驗(yàn)中，從試驗(yàn)效果和經(jīng)濟(jì)角度考慮，Taq酶適宜用量為1U。

3．2 主要研究結(jié)論

RAPD分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性是分子標(biāo)記技術(shù)在育種實(shí)際應(yīng)用中存在的一個(gè)重要問題［12］，不同物種RAPD反應(yīng)條件不同，這就需要建立一套適于該物種的RAPD反應(yīng)條件。該研究通過對體系中的各個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化，從而建立了一套適合文冠果的穩(wěn)定的RAPD反應(yīng)體系：PCR擴(kuò)增的總體積為20μL，包括30ng的模板DNA，10×PCR buffer2μL，2．0mmol·L－1Mg2＋，0．1mmol·L－1dNTPs，Taq酶1U，不足的體積用超純水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性120s，94℃變性30 s，36．9℃退火45s，72℃延伸90s，45個(gè)循環(huán)后在72℃延伸300s，結(jié)束后在4℃條件下保存。該體系為進(jìn)一步開展文冠果的種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳多樣性研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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