簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆申克孢子絲菌未知過氧化氫酶基因

王曉慧 劉偉 李若瑜

(1.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科，廈門 361004;2.北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科真菌室，北京 100034)

雙相真菌申克孢子絲菌 (Sporothrix schenckii)是孢子絲菌病的致病菌，主要引起皮膚及皮下組織感染，也可以引起黏膜、骨骼或系統(tǒng)性病變。近年來該菌引起播散型或系統(tǒng)性感染增多［1-2］，在免疫抑制患者尤其是艾滋病患者中發(fā)病率逐年增高［3-4］，逐漸受到重視。S.schenckii致病機(jī)

制至今尚不清楚，本研究采用簡并PCR聯(lián)合快速cDNA末端擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，成功克隆了S.schenckii過氧化氫酶(catalase，CAT)基因，命名為Sscat基因，為進(jìn)一步探討CAT在S.schenckii抗氧化防御機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株為S.schenckiiBMU03906，分離自皮膚淋巴管型孢子絲菌病患者，北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保存菌種。該菌株經(jīng)雙相性及菌落形態(tài)鑒定后，分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)和腦心浸汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在25℃和36℃保存。溫度實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株在37℃不生長，36℃可以生長。菌株在腦心浸汁血瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)條件下，經(jīng)過連續(xù)多次轉(zhuǎn)種后培養(yǎng)出純酵母相。實(shí)驗(yàn)前活化菌株。

1.2 試劑

LA Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、5'RACE和3'RACE試劑盒購自TaKaRa公司;純化mRNA用Oligo dT纖維素購自O(shè)mega公司;以pBluescript SK(+)質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建T-克隆載體，用于克隆PCR產(chǎn)物。

1.3 DNA，RNA提取及cDNA合成

將實(shí)驗(yàn)菌株接種于PDA斜面，25℃培養(yǎng)7 d，轉(zhuǎn)種于腦心浸汁血瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)，每7～9 d轉(zhuǎn)種1次以獲得酵母相。收集酵母相菌體，用氯化芐法提取 DNA［5］。Trizol法提取總RNA，經(jīng)Oligo dT纖維素柱純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.4 簡并引物設(shè)計(jì)

在NCBI GenBank中尋找白念珠菌、新生隱球菌、莢膜組織孢漿菌、巴西副球孢子菌、裂殖酵母、枝孢霉以及構(gòu)巢曲霉CAT的cDNA序列及氨基酸序列，經(jīng)序列比對找出上、下游兩段高度保守區(qū)(見圖1)，設(shè)計(jì)簡并引物 (見表1)。

圖1 7種真菌過氧化氫酶氨基酸序列的比較(方框?yàn)閮蓚€(gè)高度保守的區(qū)域)Fig.1 Alignment of catalase amino acids from seven fungal species

1.5 PCR擴(kuò)增 cDNA

以酵母相S.schenckii的第一鏈cDNA為模板，將上、下游簡并引物兩兩配對，采用二步PCR方法擴(kuò)增。簡并 PCR 反應(yīng)體系:cDNA 1.0 μL，10×PCR bufferⅡ (含 Mg2+2.5 mmol/L)2.5 μL，LA Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)0.5 μL，上下游引物各1 μL(20 pmol/μL)，dNTP 8 μL(2.5 mmol/L)，加水至50.0 μL。反應(yīng)條件采用兩步法:94℃ 30 s，45℃ 30 s共5個(gè)循環(huán)，72℃ 30 s共5個(gè)循環(huán)，94℃30 s共5個(gè)循環(huán)94℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，55℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，72℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物常規(guī)純化、克隆、測序。所得序列和其他已知真菌CAT基因cDNA序列進(jìn)行比對，證實(shí)為目的片段后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 簡并引物及用于3＇-和5＇-RACE的引物Tab.1 Degenerate Primers and primers used in RACE

1.6 3'RACE 和5'RACE

根據(jù)上述獲得的cDNA序列分別設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物(見表1)。3'RACE主要過程:0.2 μg mRNA經(jīng)Oligo dT-3 Sites Adaptor primer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。5'RACE主要過程:以0.1 μg mRNA 為模板，用 5'-RT-primer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，RNase H降解去除DNA-RNA雜交體中的RNA，單鏈cDNA環(huán)化后進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。二者PCR產(chǎn)物常規(guī)純化、克隆、測序。

1.7 cDNA全長克隆測序及序列分析

將上述3種方法得到的三段序列進(jìn)行拼接得到Sscat基因cDNA全長序列，將cDNA及其編碼氨基酸序列進(jìn)行比對分析。根據(jù)Sscat基因cDNA全長的頭尾序列設(shè)計(jì)1對驗(yàn)證引物，用cDNA作模板，擴(kuò)增出Sscat基因cDNA的全長編碼區(qū)，克隆測序以進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 簡并PCR結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳顯示有多個(gè)條帶，但以預(yù)期大小約268 bp處條帶最清晰 (見圖2)，對該片段切膠純化、克隆、測序，并與其他真菌的CAT基因cDNA序列比對，證實(shí)該產(chǎn)物為一潛在的在Sscat基因cDNA片段。

2.2 3'RACE 及5'RACE

3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物為400 bp和1 400 bp兩條清晰條帶，分別對以上片段進(jìn)行純化、克隆、測序及序列比對分析，證實(shí)1 343 bp產(chǎn)物為目的片段，400 bp為非特異擴(kuò)增 (見圖3)。5'RACE擴(kuò)增出600 bp單一清晰條帶，無其他非特異性擴(kuò)增(見圖4)，該片段經(jīng)純化、克隆、測序及序列比對分析，證實(shí)為691 bp目的片段。

2.3 序列分析

將簡并PCR產(chǎn)物、3'RACE及5'RACE所獲序列進(jìn)行對位拼接，獲得一條全長為1 746 bp的序列，它與一次擴(kuò)增cDNA全長所獲得的序列相同。其中開放讀碼框 (ORF)1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸，起始密碼子ATG位于全長序列第122～124位，終止密碼子 TGA位于1 619～1 621位，5'端121 bp非編碼區(qū)，3'端109 bp非編碼區(qū)。該序列與多個(gè)真菌的cDNA及氨基酸同源(見圖5)。

2.4 序列遞交NCBI Genbank(Genbank accession numberEU 364509)

2.5 內(nèi)含子確定

Sscat基因的cDNA與其基因組DNA的序列比較分析，Sscat基因包含1個(gè)71 bp內(nèi)含子，位于993～1 063位。

3 討 論

目前獲得全長cDNA克隆的分子生物學(xué)技術(shù)主要有3種:cDNA文庫篩選法、以PCR為基礎(chǔ)的cDNA末端快速擴(kuò)增法以及基于生物信息學(xué)的電子克隆技術(shù)。RACE是1988年由Forman等［6］報(bào)道的以PCR為基礎(chǔ)獲得目的cDNA完整序列的技術(shù)，它包括5'RACE和3'RACE。5'端和3'端的克隆與序列測定是全長基因分析中的關(guān)鍵，因此該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人類、昆蟲以及致病真菌未知基因克隆，如新生隱球菌、組織胞漿菌、馬內(nèi)菲青霉等。席麗艷應(yīng)用RACE技術(shù)克隆了馬內(nèi)菲青霉的Ras相關(guān)基因PmRsr1［7］。曹存巍應(yīng)用簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)克隆了馬內(nèi)菲青霉與氧化應(yīng)激相關(guān)的SKN7基因［8］。

圖2 簡并PCR擴(kuò)增結(jié)果:1，2，5，6.簡并PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示多個(gè)清晰條帶;M.marker 100 bp 圖3 3＇-RACE擴(kuò)增結(jié)果 圖4 5＇-RACE擴(kuò)增結(jié)果 圖5 過氧化氫酶氨基酸序列同源性比較Fig.2 Degenerate PCR:1，2，5，6.Amplication bands;M.marker 100 bp Fig.3 Amplication of 3＇-RACE Fig.4 Amplification of 5＇-RACE Fig.5 Multiple alignment of the Sporothrix schenckii catalase with highly similar catalases

我們應(yīng)用簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)首次克隆了申克孢子絲菌的過氧化氫酶基因Sscat，成功的關(guān)鍵在于以下3方面。①引物的合理設(shè)計(jì):簡并PCR擴(kuò)增未知基因片段通常由于非特異性產(chǎn)物而難以獲得預(yù)期的目的片段，因此簡并引物的設(shè)計(jì)成為簡并PCR成功的先決條件。引物的簡并性越低，PCR產(chǎn)物的特異性越強(qiáng)。我們分別設(shè)計(jì)了2條上游簡并引物和3條下游簡并引物，盡可能選擇簡并性小的氨基酸來設(shè)計(jì)引物，并且避免了3'末端的簡并，從而降低了引物簡并度，并且將上下游簡并引物兩兩配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增。②PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化:PCR擴(kuò)增先在非嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牡屯嘶饻囟?(45℃)下進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，隨后在較嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饻囟认逻M(jìn)行25～35個(gè)循環(huán)。簡并PCR應(yīng)當(dāng)在1～3 μmol/L比較高的引物濃度下進(jìn)行，有利于目的條帶的獲得。③合適的模板濃度:適量cDNA模板可以減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格遵循RNA提取的操作規(guī)程以防RNA降解，純化出mRNA以獲得高豐度的模板，從而提高cDNA末端的擴(kuò)增效率。在現(xiàn)階段S.schenckii基因組測序工作尚未完成的情況下，簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)是克隆S.schenckii未知基因的有效方法，值得推廣應(yīng)用。

需氧微生物具有完整的抗氧化防御系統(tǒng)，CAT是最重要的抗氧化酶之一，它能將H2O2分解為H2O和O2，保護(hù)微生物免受H2O2損傷。CAT分為:錳過氧化氫酶(該酶只存在原核生物中);雙功能復(fù)合酶過氧化氫酶一過氧化物酶 (catalase-peroxidase，cpeA);單功能過氧化氫酶，又包括大亞基單位(80 kDa左右)和小亞基單位的過氧化氫酶(即過氧化物酶體的過氧化氫酶)。Sscat基因cDNA全長1 746 bp，包含1個(gè)內(nèi)含子，其中ORF 1 500 bp，編碼499個(gè)氨基酸，分子量為56.07 kDa，其氨基酸序列與其他真菌的CAT氨基酸序列具有較高的同源性，其中與米曲霉的未命名CAT同源性最高，為66.3%，與黑曲霉、棒曲霉、土曲霉的同源性分別為56.6%、55.1%和46.7%，說明真菌的 CAT 較為保守。根據(jù)Sscat編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征，推測其為小亞基單位過氧化氫酶。

致病真菌侵入宿主后面臨諸多環(huán)境應(yīng)激，如溫度變化、高滲環(huán)境、pH改變以及氧化應(yīng)激。CAT是致病真菌抗氧化防御體系中的關(guān)鍵酶之一，可以保護(hù)真菌在宿主機(jī)體微環(huán)境中存活并且致病。在其他雙相性真菌中，如馬爾尼菲青霉、巴西副球孢子菌、組織胞漿菌和皮炎芽生菌，CAT均顯示有抵抗氧化損傷，幫助致病菌存活并參與致病的作用［9-12］。我們研究了Sscat基因在體外雙相轉(zhuǎn)化時(shí)以及在H2O2應(yīng)激中mRNA表達(dá)水平的差異，realtime PCR結(jié)果顯示，Sscat基因的mRNA表達(dá)均增高，推測CAT在S.schenckii抗氧化損傷中發(fā)揮了作用［13］。但是，這種抗氧化作用如何參與環(huán)境應(yīng)激的具體機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。總之，Sscat基因的克隆為深入探討S.schenckii Sscat基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)表達(dá)以及基因功能奠定了基礎(chǔ)。

致謝 北京大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室卜定方老師對本研究的技術(shù)指導(dǎo)。

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