中國人肺腺癌細胞系CPA-Yang3及其骨轉(zhuǎn)移細胞的建立

楊順芳 時梅萍 曹杰 蘇建中 趙蘭香 雷貝 常城 陸建英 葉劍定 謝文暉

肺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是世界性的醫(yī)學難題[1-4]。由于種種原因，肺癌患者的低齡化和腺癌化似乎有上升趨勢且缺乏有效的診療方法和手段。許多患者首診時即發(fā)現(xiàn)有多器官轉(zhuǎn)移[3]，其中骨轉(zhuǎn)移占30%-70%。由于肺癌骨轉(zhuǎn)移的生物學機制至今尚不明確，臨床缺乏有效的治療方法。因此，研究肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)病機制并探索有效的診療方法是國內(nèi)外學者長期以來的努力方向。盡管隨著分子生物學、信號傳導途徑、蛋白功能研究等基礎(chǔ)學科的發(fā)展，人類對疾病發(fā)病機理的研究手段有了突飛猛進的發(fā)展，但由于種種客觀限制，該領(lǐng)域的研究仍未有重要突破。

雖然宿主微環(huán)境因素，包括破骨細胞以及一些具有生長因子功能的基質(zhì)蛋白等對腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定的作用[3,5,6]，但腫瘤細胞自身生物學特性無疑是骨轉(zhuǎn)移發(fā)生更為主要而直接的原因。由于肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生大多見于晚期的手術(shù)禁忌患者，臨床標本取材受限，這在很大程度上遲滯了肺癌骨轉(zhuǎn)移診療研究的進展。因此，如能建立有效的人肺癌骨轉(zhuǎn)移模型，不僅能打破取材困難的瓶頸，而且所建模型可以通過多代篩選富集，更有效地發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移相關(guān)功能基因，進而利用所建模型直接進行干預(yù)性治療研究，其優(yōu)越性是臨床標本所難以企及的。

2008年6月，我們把取自一名首診肺腺癌IIIb期女性患者的胸水建成體外培養(yǎng)的肺腺癌細胞系，命名為CPAYang3。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 病史資料 女性患者65歲。“因胸悶氣急一月”來我院就診時體檢捫及雙側(cè)鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并收住入院，胸片和胸部CT：左肺塊影伴胸水。支氣管鏡檢查：左總支氣管下端粘膜充血性水腫，散在分布大量粟粒狀結(jié)節(jié)影且蔓延至上下葉支氣管開口處?；顧z：腺癌。胸水細胞學檢測為陰性。

1.2 CPA-Yang3建立過程 采集新鮮血性胸水50 mL分別吸出8 mL放入3個細胞培養(yǎng)瓶，每瓶加入2 mL不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液和三抗（青霉素、鏈霉素和慶大霉素）后搖勻，放入培養(yǎng)溫度為37oC、CO2濃度為5%的德國賀利氏BB16型二氧化碳孵養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5天后光鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)瓶底約有30%的面積已長滿細胞。早期細胞形態(tài)以貼壁細胞為主，多為大小不等的多邊形，核大、核仁2個-3個，可見分裂相，分裂后細胞仍呈貼壁狀，細胞異質(zhì)性明顯。即使傳至第30代，細胞形態(tài)和生長速度不變。凍存后復蘇良好。

1.3 致瘤率 細胞培養(yǎng)至第7天，對3瓶長滿培養(yǎng)瓶底的細胞用胰酶消化，取細胞數(shù)約為4×106，用生理鹽水洗2遍后制成細胞懸液，濃度為1×107/mL。分別接種在2只免疫缺陷小鼠（BALB/c）皮下，SPF級飼養(yǎng)。60天后仍不致瘤。傳至第4代才致瘤且100%。

1.4 染色體核型分析 按常規(guī)方法制備中期染色體標本，自然干燥。選擇分散好的分裂中期染色體進行染色體計數(shù)和顯微照相、配對以及核型分析。

1.5 繪制細胞生長曲線 取第8代、第26代和第42代3組細胞，分別制成3×105/mL的細胞懸液，吸1 mL加入35 mL細胞培養(yǎng)皿；再加入19 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液作細胞培養(yǎng)。每組每天3個培養(yǎng)皿，連續(xù)8天細胞計數(shù)并繪制生長曲線。

1.6 定量RT-PCR法測定CPA-Yang3的ESM1[7]、VEGF-C[8]、IL-6[9,10]、IL-8[11,12]、AR[13,14]、SVIL[14,15]和FN1[16]基因表達水平 以SPC-A-1國人肺腺癌細胞為基準，GAPDH為內(nèi)參，CPA-Yang3為待測細胞樣本。細胞總RNA經(jīng)Trizol試劑（GibcoBRL, Carlsbad, USA）抽提后，行RNA逆轉(zhuǎn)錄（Promega, San Luis Obispo, CA, USA）。按ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、AR序列設(shè)計引物（表1）。定量RT-PCR儀ABI Prism 7900 Sequence Detection System （Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）使用SYBR Green Mastermix 藥盒（TaKaRa, Kyoto, Japan），檢測所得到CT值。通過GAPDH均一化處理，我們對目標基因的表達變化進行計算。每一樣本進行了三復孔的定量PCR，取平均值后，數(shù)據(jù)分析采用公式如下：△Ct=Ct sample-Ct con；△△Ct=△Ct（geneX）-△Ct（GAPDH），Power值是通過計算后取結(jié)果的平均值[17]。

表1 ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、AR、SVIL和FN1的PCR引物Tab 1 Primers for real-time PCR

1.7 裸鼠心內(nèi)注射造模 實驗動物均采用BALB/c裸鼠，8周齡-10周齡， 體重18 g-20 g，雄性。由上海市腫瘤研究所提供，并在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.8 放射性核素荷瘤小鼠活體成像[18,19]將第4代瘤細胞制成濃度為1×107/mL的細胞懸液種植8只裸鼠左心室，接種量為1×106/只。兩周后每周作核素和X線活體成像。每只小鼠尾靜脈注射骨顯像劑Tc-99m MDP 111MBq，體積0.1 mL，5 h-6 h后分別在Sinmens Multi-spect（Siemens Medical Systems, Inc., Hoffman Estates, II., USA）行平面顯像和在GE Hawkeye4 Infinia Functional Imaging Scanner（GE Medical Systems, Inc., Waukesha, USA）行微孔針孔顯像。平面顯像矩陣為256×256，Zoom為2.67。采集計數(shù)為（300-500）K/幀；微孔針孔顯像矩陣為1024×1024，Zoom為1。采集體位為前后位、后前位、左側(cè)位和右側(cè)位。傳統(tǒng)人體X線攝片機（Philips Optimus Bucky Diagnost TS, Philips Healthcare, The Netherlands）行小鼠全身骨骼X線攝片（CR）。將裸鼠麻醉后俯臥位固定，X線膠片置于裸鼠下方。攝片條件：40 kV，2 mA，3 s，28 cmH[18]。發(fā)現(xiàn)放射性分布異常的骨組織后做好記錄，以便無痛處死小鼠后將可疑骨轉(zhuǎn)移灶取出做病理和轉(zhuǎn)移細胞的體外培養(yǎng)。

1.9 病理檢測和骨轉(zhuǎn)移率 每只在左心室種植CPA-Yang3細胞3周-5周間經(jīng)核素骨顯像、X線檢測且稱重后麻醉處死，每只鼠統(tǒng)一取股骨、肱骨、胸腰椎和下頜骨共7塊骨組織做病理檢測，其它部位的骨轉(zhuǎn)移根據(jù)核素骨顯像決定。將取下的骨組織10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察裸鼠腫瘤轉(zhuǎn)移情況。然后計算骨轉(zhuǎn)移率。其它臟器轉(zhuǎn)移在解剖探查時記錄。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 在相差倒置顯微鏡下觀察CPA-Yang3細胞生長情況。從第二代細胞的相差顯微鏡圖可見細胞呈貼壁生長（圖 1）。

2.2 致瘤率 裸鼠皮下種植1-3代細胞均不致瘤，傳至第4代后100%致瘤。

2.3 CPA-Yang3細胞生長曲線 取第8代、26代和42代細胞分別制成2×105/mL細胞懸液，吸入35 mL細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)；每兩天計數(shù)，連續(xù)8天，可見第2-4天為指數(shù)增殖期。第8代、26代和42代細胞的群體倍增時間分別為24.25 h、30.44 h和29.03 h（圖2）。

2.4 染色體分析 取第8代CPA-Yang3的70個中期分裂相細胞的染色體進行分析，各細胞內(nèi)染色體數(shù)目分布在35-44之間。染色體條數(shù)增加的前二位是：第2號和并列第二的1、8、23號；第19、13、14、15號減少；Y缺失。CPAYang3細胞的染色體核型分析圖（圖3）。

2.5ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、AR、SVIL和FN1基因表達水平 RT-PCR法對國人肺腺癌細胞CPA-Yang3和SPC-A-1進行ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、AR、SVIL和FN1基因表達水平的比較（圖4）。

2.6 CPA-Yang3是個除骨轉(zhuǎn)移以外具有肝、肺、頜下腺和腎上腺轉(zhuǎn)移的細胞株 第4代親代細胞經(jīng)小鼠體內(nèi)誘導后給每只裸鼠左心室分別接種1×106/0.1 mL細胞懸液，四周經(jīng)自創(chuàng)微孔針孔活體成像方法能檢出70%骨轉(zhuǎn)移；解剖時肉眼發(fā)現(xiàn)有50%肝轉(zhuǎn)移；33%肺和頜下腺轉(zhuǎn)移；17%腎上腺轉(zhuǎn)移。取膝關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)移灶培養(yǎng)骨轉(zhuǎn)移細胞成功擴增后再給裸鼠左心室注射三周后行核素骨顯像和X線拍片，80%的鼠在第2個cycle后被核素骨顯像檢出骨轉(zhuǎn)移灶而不能被X線檢出。檢出的骨轉(zhuǎn)移灶主要集中在：下頜骨、膝關(guān)節(jié)、肱骨、脊柱和肩胛骨。還見頜下腺轉(zhuǎn)移。第3個cycle小鼠左心室接種70萬骨轉(zhuǎn)移細胞，存活期減至25天-28天。檢出的轉(zhuǎn)移灶同前。第4個cycle后小鼠骨轉(zhuǎn)移同前且無其它臟器轉(zhuǎn)移（肝、肺、腎上腺、頜下腺），因此命名為CPA-Yang3BM。檢出的骨轉(zhuǎn)移灶主要集中在：下頜骨、脊柱、膝關(guān)節(jié)、肱骨、肩胛骨（圖5）。將核素微孔針孔骨顯像示小鼠骨轉(zhuǎn)移的同一小鼠拍X片后發(fā)現(xiàn)有明顯轉(zhuǎn)移的部位僅限于肩胛骨下角約5 mm3大小的轉(zhuǎn)移灶（圖6，圖7）。骨轉(zhuǎn)移細胞見圖8。

2.7 病理 荷瘤CPA-Yang3小鼠的多臟器轉(zhuǎn)移病理（圖9）

圖1 第二代CPA-Yang3細胞相差顯微鏡圖（A：×100；B：×200）Fig 1 The CPA-Yang3 cells in second passage under the contrast phase microscope (A: ×100; B: ×200)

圖3 染色體核型分析圖Fig 3 Chromosomal instability in CPA-Yang3

圖2 CPA-Yang3細胞生長曲線Fig 2 The cell growth curve of CPA-Yang3

圖4 RT-PCR法比較CPA-Yang3與SPC-A-1部分基因ESM1、VEGF-c、IL-6、IL-8、AR、SVIL和FN1的表達水平Fig 4 Real-time PCR was performed on CPA-Yang3 compare with SPC-A-1 to evaluate the expression changes of genes

圖5 微孔針孔核素骨顯像檢測小鼠骨轉(zhuǎn)移（后前位）。A：箭頭所指左右下頜骨和左肱骨、右肩胛骨轉(zhuǎn)移；B：上箭頭示胸椎轉(zhuǎn)移；C：箭頭所指兩膝關(guān)節(jié)骨轉(zhuǎn)移。Fig 5 The pinhole bone scintigraphy detected bone metastasis in vivo mice. A: Arrows show jaw bones, left humerus and right scapula metastases; B: Arrows show thoracic vertebrae metastasis; C: Arrows show knee joints metastases.

圖6 圖5鼠的X線片（后前位）Fig 6 The X ray of Fig 5 mouse

圖7 圖5鼠在核素骨顯像、X線拍片后解剖時照片F(xiàn)ig 7 The photo of Fig 5 mouse was bled and then sacrificed after bone scan and X ray detection

圖8 高骨轉(zhuǎn)移亞代細胞CPA-Yang3BM（×100）相差顯微鏡圖Fig 8 Bone-seeking clone CPA-Yang3BM under the contrast phase microscope (×100)

圖9 CPA-Yang3經(jīng)左心室接種后引發(fā)小鼠多臟器轉(zhuǎn)移病理（HE, ×100）。A：肩胛骨轉(zhuǎn)移；B：胸椎轉(zhuǎn)移；C：頜下腺轉(zhuǎn)移；D：股骨轉(zhuǎn)移；E：腎上腺轉(zhuǎn)移；F：肺轉(zhuǎn)移。Fig 9 Histological features of multi-organ metastases in the mouse with CPA-Yang3 (HE, ×100). A: scapula metastasis; B: thoracic vertebrae metastasis; C: submaxillary gland metastasis; D: femur metastasis; E: adrenal metastasis; F: lung metastasis.

3 討論

肺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是肺癌診治的世界性醫(yī)學難題，尤其是向特定器官進行靶向轉(zhuǎn)移的分子機理并不清楚。我國學者在肺癌轉(zhuǎn)移細胞系的建立方面做了有益的嘗試[20]，如部分癌細胞能否專一性很強地向某組織定向轉(zhuǎn)移而不遷徙著床到其它臟器包括原發(fā)臟器的爭論，其答案基本上是被否定的。但是，新建的國人肺腺癌細胞系中有一些細胞株就具有此特性，CPA-Yang1[21]的親代細胞就具有僅向骨骼轉(zhuǎn)移的特征。CPA-Yang3從開始多器官轉(zhuǎn)移，經(jīng)過in vivo-in vitro-in vivo四個體內(nèi)外篩選后得到一株純骨轉(zhuǎn)移的國人肺腺癌細胞系。但是，國人肺腺癌高轉(zhuǎn)移細胞株SPC-A-1BM經(jīng)體內(nèi)外篩選8個cycles后，仍不是一株具有骨轉(zhuǎn)移而無其它臟器轉(zhuǎn)移特性的細胞株。CPAYang2[22]傳至第11代后方可表現(xiàn)多器官轉(zhuǎn)移特性。歸根到底，腫瘤細胞能否專一地向某臟器靶向轉(zhuǎn)移還是由本身的生物學特性所決定的。但要找到這些向特定器官或組織轉(zhuǎn)移的靶標而且對它們的轉(zhuǎn)移機制進行具有說服力的詳細闡述說明，這需要付出更多的努力，也是我們正在做的工作。

前期研究[18,19,23]將不同cycles獲得的骨轉(zhuǎn)移細胞SPCA-1BM和其親代細胞SPC-A-1雜交，通過cDNA和全基因組的Illumina芯片實驗篩選出部分骨轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。經(jīng)RT-PCR驗證確定幾個重點關(guān)注的基因并已作了報道。其中部分基因在Yang1-Yang3都得到了驗證。

Sarrazin等[7]提出ESM1能作為一個腫瘤治療和檢測的標志物和靶標。

IL-6是肺癌的一種自分泌生長因子，肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生溶骨性骨吸收過程中，IL-6作為誘導破骨細胞生成的細胞因子，通過刺激成骨細胞和基質(zhì)細胞，增加其表面RANKL表達的間接作用方式，發(fā)揮其生物學效應(yīng)[9-10]。

Yuan等[11]和Masuya等[12]發(fā)現(xiàn)肺癌組織中IL-8mRNA表達水平與血管生長、p53抑癌基因異常以及巨噬細胞浸潤數(shù)量密切相關(guān)，并且IL-8過表達者易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。

SVIL是個肌動蛋白結(jié)合蛋白（亦稱監(jiān)理蛋白），在Hela、SW480腺癌和A549肺腺癌細胞株中均有表達。AR的激活是由生長和分化中肌細胞的雄激素而定。SVIL作為AR的參與調(diào)節(jié)者來自骨骼肌cDNA文庫。SVIL能增強PC-3前列腺癌細胞內(nèi)源性AR的靶基因。SVIL是AR的共同調(diào)節(jié)者能增強AR在肌細胞和其它細胞的轉(zhuǎn)移激活[13-15]。

纖連蛋白（FN1）在促進細胞附著、遷移、分化和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。FN可激活原癌基因c-fos和c-Jun的活動，從而使FN的表達與肝細胞癌（HCC）的分化、侵入和轉(zhuǎn)移呈高度相關(guān)。FN1在國人肺腺癌骨轉(zhuǎn)移細胞（SPC-A-1BM）中呈高表達[19]。RT-PCR法檢測ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、AR、SVIL和FN1基因表達水平在國人肺腺癌細胞CPA-Yang3中均上調(diào)，肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展、形成是否與這些基因相關(guān)，值得深入研究和探討。

4 結(jié)論

新建的中國人肺腺癌細胞CPA-Yang3和它的骨轉(zhuǎn)移細胞系CPA-Yang3BM是個高潛能轉(zhuǎn)移細胞系，經(jīng)過四個cycles體內(nèi)外定向篩選獲得骨轉(zhuǎn)移細胞株。這對于骨轉(zhuǎn)移機制的研究又多了個良好的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

鳴謝

衷心感謝馮久賢、包國良、江一峰、鄭志春等專家、同道和放射科技術(shù)組的同志們長期以來對本研究給予的熱情支持和大力協(xié)助。以及中科院生命科學院健康研究所胡斌在RT-PCR檢測中的精益求精。