晚期肺腺癌患者化療前后血清EGFR基因突變狀態(tài)的比較

韓如冰 鐘巍 趙靜 張力 夏瑩 王寒 李龍蕓 王孟昭

越來越多的證據(jù)表明非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突變狀態(tài)影響NSCLC的治療策略。近90%的EGFR基因突變集中于外顯子19的缺失突變和外顯子21點(diǎn)突變[1,2]。對(duì)于EGFR基因突變陽性的NSCLC患者，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI），包括吉非替尼和厄洛替尼，有明顯療效。然而我們應(yīng)注意到，對(duì)于最初EGFR基因突變陽性的人群，EGFR-TKIs作為二/三線治療和一線治療的客觀有效率是有差異的，分別為30%-40%[3-5]和70%[6-8]。因此我們推測(cè)化療會(huì)對(duì)EGFR基因突變狀態(tài)產(chǎn)生影響，從而影響EGFR-TKIs作為NSCLC二/三線治療的有效率。

然而化療前后分別取肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)臨床實(shí)踐困難。研究[9]表明，實(shí)體腫瘤形成和發(fā)展過程中常有少量的腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血循環(huán)，此類癌細(xì)胞在血循環(huán)中凋亡并將遺傳物質(zhì)釋放到血液中，這提示血液游離DNA可成為檢測(cè)腫瘤基因突變的一種方法，而且標(biāo)本獲得更加方便。幾項(xiàng)較大樣本的研究[10,11]均發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者血清和腫瘤組織EGFR基因突變狀態(tài)檢測(cè)的一致性為79.7%-94%，這些研究提示血清DNA可替代腫瘤組織DNA進(jìn)行腫瘤EGFR基因突變檢測(cè)。本研究收集晚期肺腺癌患者化療前后的配對(duì)血清標(biāo)本，使用酶切突變富集巢式PCR法直接測(cè)序進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，觀察化療對(duì)EGFR基因突變狀態(tài)是否存在影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2009年11月-2010年5月就診于北京協(xié)和醫(yī)院呼吸內(nèi)科肺癌中心的患者血清標(biāo)本?；颊呷脒x標(biāo)準(zhǔn)包括：組織學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的肺腺癌患者，分期為IIIb期或IV期，有全身化療前和化療2個(gè)-6個(gè)周期后的配對(duì)標(biāo)本。每次收集全血標(biāo)本2 mL，分離血清，-20oC保存。共收集化療前后配對(duì)標(biāo)本33例。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用磁珠法提取200 μL血清中游離DNA（磁珠法游離DNA提取試劑盒，北京金麥格生物技術(shù)有限公司），獲得游離DNA 30 μL，測(cè)得平均DNA濃度為7.3 ng/μL（2.7 ng/μL-17.4 ng/μL），置于1.5 mL離心管中凍存?zhèn)溆谩?/p>

EGFR基因外顯子19和21的擴(kuò)增采用酶切突變富集巢式PCR法。引物的序列見表1（上海Invitrogen公司合成）。第一輪PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括GoTaq mix 5 μL、上下游引物（10 pm/μL）各0.5 μL、基因組DNA 3 μL，無核酸水補(bǔ)齊至10 μL。反應(yīng)條件為95oC、5 min；95oC、30 s，56oC、30 s，72oC、50 s，5個(gè)循環(huán)；95oC、3 s，61oC、30 s，72oC、50 s，15個(gè)循環(huán)；72oC、10 min。

酶切反應(yīng)體系及條件：體系20 μL，包括PCR1產(chǎn)物1 μL、限制性內(nèi)切酶Mse I 0.5 μL（外顯子19）或限制性內(nèi)切酶Msc I 0.5 μL（外顯子21）、10×buffer 1 μL，無核酸水補(bǔ)齊至20 μL；反應(yīng)條件為37oC、5 h。

第二輪PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括GoTaq mix 12.5 μL、上下游引物（10 pm/μL）各1.5 μL、模板DNA（即PCR1產(chǎn)物酶切后的DNA）1 μL，無核酸水補(bǔ)齊至25 μL。外顯子19反應(yīng)條件為95oC、5 min；95oC、30 s，55oC、30 s，72oC、30 s，40個(gè)循環(huán)；72oC、10 min。外顯子21反應(yīng)條件為95oC、5 min；95oC、30 s，58oC、30 s，72oC、30 s，40個(gè)循環(huán)；72oC、10 min。

1.3 EGFR基因外顯子19和21突變狀態(tài)判斷 最終PCR產(chǎn)物由上海Invitrogen公司完成測(cè)序，使用DNAMAN軟件閱讀序列。EGFR基因外顯子19突變?yōu)槿笔蛔?，巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)序結(jié)果與野生序列進(jìn)行比對(duì)，若與野生型序列吻合，判讀為野生型；若為單一序列且其序列表現(xiàn)為一段堿基缺失時(shí)，判讀為突變型；若為野生型序列和突變型序列的疊加，也判讀為突變型（圖1）。EGFR基因外顯子21突變?yōu)長(zhǎng)858R點(diǎn)突變，巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)序結(jié)果與野生序列進(jìn)行比對(duì)，若與野生型序列吻合，判讀為野生型；若為單一序列且其序列表現(xiàn)為突變型堿基G時(shí)，判讀為突變型；若為野生型序列和突變型序列的疊加，即野生型堿基T和突變型堿基G混合，也判讀為突變型（圖2）。EGFR基因敏感突變包括外顯子19的缺失突變和/或外顯子的21點(diǎn)突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用χ2檢驗(yàn)分析不同亞組患者EGFR基因突變率的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況 入組33例患者中男性20例，女性13例；年齡36歲-75歲，中位年齡57歲；吸煙者11例，不吸煙者22例。其中29例接受一線化療，方案包括吉西他濱聯(lián)合鉑類13例，紫杉醇聯(lián)合鉑類10例，培美曲塞聯(lián)合順鉑5例，VP-16聯(lián)合順鉑1例；4例接受二線單藥多西紫杉醇化療?；煰熜В翰糠志徑猓╬artial response,PR）5例，疾病穩(wěn)定（stable disease, SD）22例，疾病進(jìn)展（progresive disease, PD）6例。

2.2 化療前血清EGFR基因突變狀態(tài) 化療前血清DNA樣本檢測(cè)結(jié)果顯示患者EGFR基因突變發(fā)生率為39.4%（13/33）。外顯子19突變8個(gè)，突變率為24.2%（8/33），外顯子21突變11個(gè)，突變率為33.3%（11/33），可見以外顯子21突變?yōu)橹鳎?7.9%, 11/19），其中6例患者同時(shí)伴有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為46.2%（6/13），男性患者突變率為35.0%（7/20），女性高于男性，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.52）。吸煙患者突變率為45.5%（5/11），不吸煙患者突變率為36.4%（8/22），吸煙患者略高于不吸煙患者，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.61）。

表1 EGFR基因外顯子19和21巢式PCR擴(kuò)增引物序列Tab 1 Primer sequences used for nested PCR of exon 19 and 21 of EGFR gene

圖1 EGFR外顯子19 PCR2產(chǎn)物直接測(cè)序圖。A：野生型序列；B：混合型序列；C：突變型序列。Fig 1 Direct sequencing of PCR2 products for exon 19 of EGFR gene. A: wild type; B: mixture of both wild and mutant type; C: mutant type.

圖2 EGFR外顯子21 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序圖。A：野生型序列；B：混合型序列；C：突變型序列。Fig 2 Direct sequencing of PCR products for exon 21 of EGFR gene. A: wild type; B: mixture of both wild and mutant type; C: mutant type.

2.3 化療后血清EGFR基因突變狀態(tài) 化療后血清DNA樣本檢測(cè)結(jié)果顯示患者EGFR基因突變發(fā)生率為54.5%（18/33）。外顯子19突變10個(gè)，突變率為30.3%（10/33），外顯子21突變14個(gè)，突變率42.4%（14/33），可見以外顯子21突變?yōu)橹鳎?8.3%, 14/24），其中6例患者同時(shí)伴有外顯子19和21突變。女性患者EGFR基因突變率為38.5%（5/13），男性患者突變率為65.0%（13/20），女性低于男性，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.14）。吸煙患者突變率為72.8%（8/11），不吸煙患者突變率為45.5%（10/22），吸煙患者高于不吸煙患者，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.14）。

2.4 化療前后的比較 化療前患者檢出EGFR基因敏感突變陽性率為39.4%（13/33），化療后患者檢出EGFR基因敏感突變陽性率為54.5%（18/33），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.51）?；颊呋熐昂驟GFR基因敏感突變狀態(tài)一致率為54.5%（18/33），患者化療前后EGFR基因敏感突變具體變化見表2。

對(duì)于EGFR外顯子19缺失突變，化療前陽性率為24.2%（8/33），化療后陽性率為30.3%（10/33），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.16），其中化療前后均陽性4例，化療前后均陰性19例患者，化療前陰性化療后陽性6例，化療前陽性化療后陰性4例。對(duì)于EGFR外顯子21點(diǎn)突變，化療前陽性率為33.3%（11/33），化療后陽性率為42.4%（14/33），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.08），其中化療前后均陽性7例，化療前后均陰性15例，化療前陰性化療后陽性7例，化療前陽性化療后陰性4例。

2.5 化療前后EGFR基因突變狀態(tài)變化與療效的關(guān)系 化療前后EGFR基因突變狀態(tài)變化與療效的關(guān)系見表3，可見基因突變狀態(tài)的變化與化療療效無明顯相關(guān)性（χ2=3.26,P=0.775）。

3 討論

本研究前瞻性分析了化療是否會(huì)對(duì)NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)產(chǎn)生影響，結(jié)果顯示化療后EGFR基因敏感突變陽性率似乎高于化療前（54.5%vs39.4%），化療前后EGFR基因突變狀態(tài)一致率僅為54.5%（18/33）；不一致的15例中，10例由化療前EGFR基因突變陰性變?yōu)殛栃裕?例由化療前陽性變?yōu)殛幮浴?/p>

分析化療前后EGFR基因突變狀態(tài)發(fā)生變化的原因有很多推測(cè)或假設(shè)。首先，化療對(duì)于EGFR基因突變陽性的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性，可以使外周血中EGFR突變基因比例增高。IPASS研究[7]中EGFR基因突變陽性人群化療的客觀有效率為47.3%；日本NEJ002研究[8]中EGFR基因突變陽性人群一線化療的客觀有效率為29%；WJTOG3405研究[12]中EGFR基因突變陽性人群一線化療的客觀有效率為32.2%，均高于文獻(xiàn)報(bào)道的非選擇性人群含鉑雙藥方案的大約20%的客觀有效率，這提示EGFR基因突變陽性腫瘤對(duì)化療藥物更加敏感，化療可能使EGFR基因突變陽性的腫瘤細(xì)胞更易被殺傷，因而釋放更多DNA入血，因此化療后突變陽性比例升高。

其次，腫瘤在進(jìn)展過程中EGFR基因突變狀態(tài)可能發(fā)生變化。Gow等[13]對(duì)67例NSCLC患者腫瘤組織及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，結(jié)果顯示18例原發(fā)灶樣品EGFR基因突變陽性，而其中9例（50%）轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為EGFR基因突變陰性，而轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為EGFR基因突變陽性的26例樣品中，相應(yīng)的原發(fā)灶有17例（65%）表現(xiàn)為突變陰性，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變狀態(tài)的不一致多是由于轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為EGFR基因突變陽性而原發(fā)灶表現(xiàn)為陰性造成的。因此，在腫瘤發(fā)展過程中可能存在EGFR基因突變狀態(tài)的改變，而且可能以轉(zhuǎn)移灶EGFR基因突變陽性率增高為主。

化療也可能促使EGFR基因耐藥突變的產(chǎn)生。Chin等[14]將含有EGFR外顯子19缺失突變的NSCLC細(xì)胞系-PC9細(xì)胞系經(jīng)過鉑類化療藥物處理耐藥后，再使用厄洛替尼，發(fā)現(xiàn)厄洛替尼的敏感性降低，說明化療可能在酪氨酸激酶激活通路中發(fā)揮作用。因此二/三線EGFR-TKIs治療有效率的降低可能部分歸因于化療導(dǎo)致的EGFR-TKIs耐藥，具體機(jī)制有待進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。

本研究結(jié)果提示化療前后肺腺癌患者的EGFR基因突變狀態(tài)可能會(huì)發(fā)生變化，本研究雖然采用了前瞻性設(shè)計(jì)來收集標(biāo)本，但是仍然存在一定缺陷。樣本量小會(huì)產(chǎn)生一定的偏差，需要設(shè)計(jì)大樣本多中心的臨床試驗(yàn)；采用外周血DNA檢測(cè)，雖然樣本能相對(duì)容易獲得，但不如組織標(biāo)本更有說服力，需要化療前后的患者組織標(biāo)本來證實(shí)我們發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象；本實(shí)驗(yàn)中外周血標(biāo)本是在化療前和化療后采集的，實(shí)際上應(yīng)該采集化療前和化療后患者疾病進(jìn)展時(shí)的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，更能對(duì)治療提供線索。因此希望能開展多中心大樣本的臨床試驗(yàn)并收集化療前和化療后疾病進(jìn)展時(shí)的組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)以證實(shí)化療對(duì)EGFR基因突變狀態(tài)的影響。

表2 33例患者化療前后EGFR基因突變狀態(tài)具體變化Tab 2 The EGFR gene mutation status of pre- and post-chemotherapy serum samples in 33 patients enrolled

表3 33例患者化療前后EGFR基因突變狀態(tài)變化與療效的關(guān)系Tab 3 The profile of EGFR gene mutation status of pre- and post-chemotherapy serum samples and its relation with efficacy of chemotherapy in 33 patients enrolled