CT導(dǎo)引下32P-磷酸鉻-聚-L-乳酸粒子植入治療兔VX2肺腫瘤的實驗研究

潘棟輝 楊敏 徐宇平 王立振 劉璐 黃培林

手術(shù)切除、化療和外放療是腫瘤治療的主要手段,但存在著復(fù)發(fā)率高、治療效果不理想和毒副作用大等缺陷[1].目前,載有放射性核素如32P、90Y、166Ho、188Re和32P等的藥物內(nèi)照射治療惡性實體瘤已經(jīng)取得較好的成效[2-5].這些放射性藥物能直接作用于靶點(diǎn),同時對正常組織影響較小.相對于其它β射線發(fā)射核素,32P價廉易得且物理學(xué)性能良好.間質(zhì)注射膠體32P-磷酸鉻(32P-CP)在治療肺癌、乳腺癌和腦腫瘤等惡性實體瘤方面有一定的應(yīng)用價值[6-8].但研究[9]發(fā)現(xiàn),隨著32P-CP間質(zhì)給藥劑量的加大,全身藥物分布亦增加,對正常組織如肝、脾等的毒性也加大.因此,尋找一種靶向定位更佳的載體形式成為放射性核素內(nèi)照射治療研究的重點(diǎn).聚L-乳酸(poly l-lactic acid, PLLA)是一種生物相容性良好的高分子材料,作為藥用輔料被廣泛應(yīng)用于藥物緩釋系統(tǒng)[10].先前研究[11]表明,由32P-CP和PLLA混合制備成的32P-磷酸鉻-聚-L-乳酸(32P-CP-PLLA)粒子錨定在植入點(diǎn),穩(wěn)定性良好.

VX2鱗癌細(xì)胞株是由Shoppe病毒誘發(fā)的乳頭狀瘤惡變后經(jīng)兔傳代而取得的實驗性腫瘤.兔VX2腫瘤具有易于移植、侵襲性強(qiáng)、成功率高的特點(diǎn),其形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特性與人類腫瘤相似,并且生長周期短,非常適合實驗研究[12].近10年肺癌發(fā)病率和死亡率均有明顯增高趨勢.本研究以荷VX2肺癌兔為模型,采用18F-FDG PET/CT顯像及病理學(xué)研究對32P-CP-PLLA粒子瘤體間植入近距離治療的療效進(jìn)行了評價.

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔,4月齡-5月齡,2.0 kg-3.0 kg,雌雄不限,由南京安立默科技有限公司提供.

1.2 實驗器材與藥品32P-CP-PLLA粒子由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院臨床核醫(yī)學(xué)中心提供[13].32P-CP-PLLA粒子為淡綠色圓柱體,無菌,活度為93 MBq/枚.bcl-2和bax免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司.

1.3 麻醉方法 采用25%烏拉坦麻醉,劑量為1 g/kg,腹腔注射.5 min后達(dá)到麻醉效果,此時兔處于昏睡狀態(tài),對手術(shù)刺激無明顯反應(yīng).

1.4 模型制作方法 將帶有VX2腫瘤的荷瘤兔(上海交通大學(xué)實驗動物中心贈予)麻醉后,無菌條件下取出腫瘤,置于生理鹽水中.在超凈臺用眼科剪剪成1 mm3小瘤塊備用.

將正常新西蘭大白兔麻醉后,仰臥位固定于自制手術(shù)木架,置于CT機(jī)床上.左胸部剪毛.取右胸第4-5肋間肩胛骨前緣為穿刺點(diǎn),消毒穿刺點(diǎn).將瘤塊置入18 G穿刺針中,瘤塊的前后均放置0.5 cm長無菌明膠海綿條.在CT引導(dǎo)下刺入左下肺,用針芯推入肺組織中拔針.手術(shù)結(jié)束,CT掃描肺部,無明顯的氣胸發(fā)生.術(shù)后3天內(nèi)實驗兔注射青霉素60萬IU/只.3周后行CT檢查,當(dāng)腫瘤直徑為10 mm左右,即得荷VX2肺癌兔模型.

1.532P-CP-PLLA粒子瘤體間植入近距離治療 24只荷瘤兔隨機(jī)分成4組,每組6只,雌雄各半.荷瘤兔麻醉后,以仰臥位固定于機(jī)床上.在CT導(dǎo)引下經(jīng)皮穿刺分別將1枚、2枚和4枚32P-CP-PLLA粒子分別植入1組、2組和3組荷瘤兔肺部腫瘤組織內(nèi),各組總放射性活度分別為93 MBq、185 MBq和370 MBq.4組荷瘤兔為空白對照組,不作任何干預(yù).

1.6 PET/CT顯像 儀器為美國GE公司Discovery LE型.荷瘤兔PET/CT顯像前至少禁食6 h以上.荷瘤兔麻醉后仰臥位固定于機(jī)床上.耳緣靜脈注射18F-FDG 37 MBq/kg(南京安迪科正電子研究發(fā)展有限公司提供)55 min-60 min后行18F-FDG/PET檢查.先行CT透射掃描,然后進(jìn)行PET發(fā)射掃描.經(jīng)衰減校正和迭代重建后獲得CT、PET及兩者融合圖像.

1.7 標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standardized uptake value, SUV)檢測 利用Xeleris圖像融合工作站調(diào)用PET/CT圖像,獲得橫斷面數(shù)據(jù),利用CT圖像準(zhǔn)確獲取腫瘤最大切面,在PET圖像上勾畫腫瘤邊緣,取放射性濃聚比較均勻的部位進(jìn)行SUV檢測,獲得腫瘤組織最大SUV(SUVmax).1組-4組分別在治療后第0天(治療當(dāng)天)、第3天、第7天和第14天進(jìn)行PET/CT顯像.

1.8 病理學(xué)檢查 第14天PET顯像后處死大白兔,取出腫瘤組織,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林固定,石蠟包埋.進(jìn)行常規(guī)HE染色,觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化.采用SP法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax的表達(dá).bcl-2和bax陽性表達(dá)均表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒沉淀.每張切片隨機(jī)選取6個高倍視野(X400),每個視野計數(shù)200個細(xì)胞.bcl-2和bax的表達(dá)強(qiáng)度以視野內(nèi)陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率(%)表示,并取平均值.bcl-2/bax比值根據(jù)bcl-2和bax百分率計算.

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件,數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較.以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PET/CT表現(xiàn)32P-CP-PLLA粒子瘤體間植入近距離治療前后治療區(qū)組織的PET顯像如圖1所示.第0天時,治療組和對照組之間SUVmax無明顯差異(圖2).治療后第14天,治療組放射性濃聚較對照組明顯減少.1組、2組和3組SUVmax值分別為1.1±0.19、0.80±0.10和2.85±0.15,均較對照組(5.61±0.50)明顯下降(P<0.05).第7天-第14天時,1組和2組SUVmax較第3天呈持續(xù)下降趨勢,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系.治療后第3天-第14天,3組SUVmax較第0天明顯上升,并在第7天達(dá)到峰值,后明顯下降.同期3組SUVmax明顯低于對照組.

2.2 形態(tài)學(xué)觀察 治療后第14天,病理切片顯示近粒子處的腫瘤細(xì)胞核縮小,部分破裂溶解,胞漿出現(xiàn)空泡,有均質(zhì)紅染的壞死區(qū)域.壞死程度隨劑量的增加而嚴(yán)重,但遠(yuǎn)離粒子處仍可見存活腫瘤細(xì)胞.3組可見壞死組織周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤,而1組-2組炎性細(xì)胞浸潤不明顯.對照組腫瘤細(xì)胞排列密集,核大,深染,瘤巨細(xì)胞多見,無明顯壞死和炎癥(圖3A).

圖 1 兔VX2肺癌PET/CT顯像圖.A、B、C和D分別為對照組、1組、2組和3組治療第0天時PET/CT顯像圖.E、F、G和H分別為對照組、1組、2組和3組治療第14天時PET/CT顯像圖.Fig 1 PET/CT images of rabbit VX2 lung tumor. A, B, C and D are the PET/CT images of rabbit VX2 lung tumor of the control, group 1, group 2 and group 3 at d0. E, F, G and H are the PET/CT images of rabbit VX2 lung tumor of the control, group 1, group 2 and group 3 at d14 after treatment respectively.

圖 2 32P-CP-PLLA粒子植入后兔VX2肺癌最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUVmax)變化圖Fig 2 Changes in the SUVmax of rabbit VX2 lung tumor after implanted with 32P-CP-PLLA microparticle

圖 3 瘤體植入粒子后第14天腫瘤病理切片圖.A:第14天后,1組、2組、3組和4組HE染色圖及bcl-2和bax的免疫組化圖片;B:bcl-2和bax定量分析圖.*:與對照組比較,P<0.05;+各治療組之間比較,P<0.05.Fig 3 Histology and immunohistochemistry. A: Tumor stained with HE, bcl-2 and bax of the control, group 1, group 2 and group 3 on d14 after treatment respectively; B: Quantitative assessment of bcl-2 and bax expression. *: P<0.05, bcl-2 and bax expressions of treated group was significantly different than that of the control group; +: P<0.05. Significant differences were seen in bcl-2 and bax expression between each treated groups.

2.3 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 治療第14天后,1組-4組bcl-2和bax的表達(dá)強(qiáng)度及bcl-2/bax比值如圖3B所示.治療組bcl-2表達(dá)強(qiáng)度和bcl-2/bax比值均明顯低于對照組,而bax的表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于對照組(P<0.05).bcl-2和bax的表達(dá)強(qiáng)度及bcl-2/bax比值均與劑量明顯相關(guān).

3 討論

放射性藥物內(nèi)照射治療實體瘤療效已得到證實.其方法是將放射源置于病變部位或其周圍,放射源發(fā)出射線,其在有效射程內(nèi)使腫瘤組織發(fā)生血管萎縮、細(xì)胞凋亡或壞死[11].目前,內(nèi)照射治療已用于惡性實體瘤如肝癌、肺癌和胰腺癌等的治療,效果良好.32P是理想的治療用放射性核素.32P發(fā)射純β射線,其最大能量為1.7 MeV,最大組織內(nèi)射程為8 mm,物理半衰期為14.3天[14].先前研究[11]表明32P-CP-PLLA粒子將能量絕大部分釋放在植入點(diǎn),對其它非植入臟器影響較低.與膠體32P-CP相比,32P-CP-PLLA粒子有效地提高了使用的安全性.

新西蘭大白兔具有性格溫順、便于試驗操作等優(yōu)點(diǎn).VX2移植瘤屬于鱗癌,種植后易成活[15].本研究以荷VX2肺癌兔為模型,觀察了32P-CP-PLLA粒子植入對VX2肺癌的治療效果.

由于治療后腫瘤的形態(tài)改變不會立即顯現(xiàn),且腫瘤中包含的非活性物質(zhì)(例如壞死)、受損的細(xì)胞會使診斷發(fā)生困難,因此傳統(tǒng)解剖學(xué)影像檢查(CT或MRI)可能不適于早期療效監(jiān)測[16].

與CT相比,18F-FDG/PET在臨床上療效評價中有一定的優(yōu)勢.惡性腫瘤細(xì)胞的異常增殖需要葡萄糖的過度利用.葡萄糖代謝顯像正是利用了腫瘤這種代謝特點(diǎn).18F-FDG是葡萄糖的類似物,靜脈注射后經(jīng)PET顯像可靈敏檢測出與腫瘤細(xì)胞活性相關(guān)的異常葡萄糖代謝.臨床上,18F-FDG PET顯像可以有效地監(jiān)測腫瘤放化療的療效[17].

第14天時,治療組的SUVmax值明顯低于對照組,表明32P-CP-PLLA粒子瘤體間植入近距離治療降低了腫瘤細(xì)胞的活性從而抑制了其葡萄糖代謝功能,這與病理學(xué)觀察的結(jié)果相一致.18F-FDG/PET顯示治療后第7天-第14天,1組和2組的SUVmax較第3天明顯下降,且存在劑量效應(yīng)關(guān)系.該效應(yīng)關(guān)系與病理學(xué)分析結(jié)果相一致,提示18F-FDG/PET顯像能監(jiān)測中、低劑量(93 MBq-185 MBq)粒子內(nèi)照射治療后腫瘤組織的變化.形態(tài)學(xué)觀察表明,治療第14天后,3組壞死腫瘤組織周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤.由于18F-FDG/PET不能區(qū)分炎性和增殖腫瘤細(xì)胞引起的異常葡萄糖代謝,因此,治療第3天-第14天后,3組SUVmax值較治療前(第0天)明顯升高.鑒于炎癥反應(yīng)的干擾,18F-FDG/PET顯像不能精確反映高劑量(370 MBq)粒子內(nèi)照射治療后腫瘤組織的變化.

治療組病理學(xué)切片顯示,近粒子處腫瘤細(xì)胞變性壞死,提示32P-CP-PLLA粒子持續(xù)照射可直接殺傷腫瘤細(xì)胞.遠(yuǎn)離粒子處雖可見存活腫瘤細(xì)胞,但凋亡基因如bcl-2和bax的表達(dá)明顯異于對照組.bcl-2為抗凋亡基因,其下調(diào)有利于降低腫瘤細(xì)胞對放化療的抗性,利于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;bax為凋亡基因,其表達(dá)增高可抑制bcl-2的功能,促進(jìn)凋亡,有利于腫瘤細(xì)胞死亡并可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展.bcl-2和bax可形成異二聚體,兩者的比例與凋亡密切相關(guān)[18].研究結(jié)果表明32P-CP-PLLA粒子可通過電離輻射誘導(dǎo)bcl-2和bax基因參與VX2移植瘤細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控,從而抑制腫瘤生長,表現(xiàn)為bcl-2/bax比值明顯下調(diào).治療第14天后,凋亡基因如bcl-2和bax的表達(dá)強(qiáng)度與粒子的放射性劑量明顯相關(guān).

本研究表明,32P-CP-PLLA粒子明顯抑制VX2腫瘤的糖代謝,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡.由于VX2腫瘤和臨床腫瘤的生物學(xué)特性并不完全相同,32P-CP-PLLA粒子內(nèi)照射治療的效果有待進(jìn)一步研究.