P(St-g-NIPAAm)支架的制備與細(xì)胞生長(zhǎng)行為研究

陳廣涵 朱文卿 徐建江 沈新元

良好的支架材料有助于引導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng),決定著所構(gòu)建組織的形態(tài),對(duì)于組織工程角膜的構(gòu)建意義重大[1]。

組織工程角膜研究主要應(yīng)用膠原、羊膜、殼聚糖等天然高分子材料作為支架材料,但或多或少都存在細(xì)胞黏附力低、降解速率低和可能引起醫(yī)源性感染等缺點(diǎn)。人工合成智能高分子聚 N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)由于具有良好的溫敏特性,因此在生物和制藥等方面具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[2～4]。有關(guān)PNIPAAm的研究很多,但大多集中在藥物釋放、酶的固定化以及生物分離等方面,而將 PNIPAAm用于組織工程材料的研究則很少報(bào)道[5,6]。Nishida[7]等首次將其制成溫度敏培養(yǎng)皿用于培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞,并獲得了成功。

本研究將溫敏性合成聚合物PNIPAAm接枝于組織培養(yǎng)用的聚苯乙烯培養(yǎng)皿(TCPS)表面,利用改變溫度來調(diào)控細(xì)胞的黏附,為利用溫度敏感性支架材料構(gòu)建組織工程角膜緣干細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

1.試劑與儀器:異丙基丙烯酰胺(NIPAAm),分析純,Tokyo chemical industry(日本);異丙醇,分析純,上海試劑一廠;電子加速器,上海先鋒電機(jī)廠;傅里葉變換紅外光譜(FTIR):Thermo NicoletModel Nexus 670型紅外光譜儀,美國(guó) Nicolet公司;視頻接觸角測(cè)量?jī)x,Dataphysics公司(德國(guó));差示掃描量熱:Q 2000DSC,美國(guó) TA儀器;掃描電子顯微鏡(SEM):JSM—5600LV型,JEOL日本電子株式會(huì)社制造

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)P(St-g-NIPAAm)支架的制備:將NIPAAm溶于異丙醇,配成 55wt%的溶液,取該溶液 50μl滴于聚苯乙烯(PS)膜表面,搖勻,使其在膜表面充分蔓延。用電子加速器對(duì)其進(jìn)行電子束輻射。最后以蒸餾水清洗膜表面,去除未接枝上的單體和其他雜質(zhì)。(2)接枝率的計(jì)算:將反應(yīng)物和生成物稱重,根據(jù)下式計(jì)算反應(yīng)的接枝效率:GE(%)=[(Wg-Wn)/Wm]×100%。其中 Wg、Wn和 Wm分別代表接枝物(St-g-NIPAAm)共聚膜、PS膜和異丙基丙烯酰胺NIPAAm的重量。(3)支架化學(xué)結(jié)構(gòu)的測(cè)定:將PS膜及P(St-g-NIPAAm)支架樣品通過 KBr壓片,用紅外光譜儀分別測(cè)定其紅外光譜。(4)支架溫度敏感性的測(cè)定:使用差熱分析儀測(cè)定共聚物的轉(zhuǎn)變溫度,觀察其峰值。氮?dú)鈿夥毡Ｗo(hù),溫度由從 20℃升溫到 50℃(升溫速率為 2℃/min)。(5)支架親/疏水性的測(cè)定:將共聚膜置于測(cè)量平臺(tái)上,滴水,用接觸角測(cè)量?jī)x觀察液滴的形態(tài)變化,并記錄所測(cè)接觸角數(shù)據(jù)。(6)支架溶脹性能的測(cè)定:稱出膜的干重,將干膜浸于蒸餾水中,在20℃到 50℃區(qū)間內(nèi)分別做升降溫處理,并稱重。支架的溶脹率(swelling ratio,SR)由下式求得:SR=[(ms-md)/md]×100%。式中 ms為濕膜的重量,md為干膜質(zhì)量。(7)P(St-g-NIPAAm)支架的細(xì)胞培養(yǎng)與生長(zhǎng)行為測(cè)定:將剪下的兔口腔黏膜組織用 PBS液浸泡 0.5h,將其置于直徑為 3cm2的P(St-g-NIPAAm)支架表面,將支架浸入 0.25%DispaseⅡ中于 4℃過夜。在超凈臺(tái)中撕下口腔黏膜上皮,置入加有0.05%胰酶-EDTA的培養(yǎng)皿于 37℃恒溫?fù)u床中,消化 20min后在離心機(jī)離心,去上清液,加培養(yǎng)液混勻。按 106/ml細(xì)胞密度接種在用絲裂霉素處理過的 3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,加入培養(yǎng)液 8ml,放入 37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng) 3～4天后首次換液,之后隔天換液。利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況,并拍照。標(biāo)本置于 HE染色,然后在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)。

結(jié) 果

1.聚合反應(yīng)的接枝率:原 PS膜質(zhì)量 Wn=0.3270mg,NIPAAm質(zhì)量 Wm=0.0362mg,將制得的共聚物干燥后稱量,得共聚膜質(zhì)量 Wg=0.3412mg。按接枝率的計(jì)算式得到接枝率為 39.2%。

2.P(St-g-NIPAAm)支架的化學(xué)結(jié)構(gòu):比較圖1中的圖譜 a、b,我們發(fā)現(xiàn)圖譜 b在 1506cm-1處的-NH2振動(dòng)吸收峰因變形運(yùn)動(dòng)和羰基 -C=的作用而移至圖譜 a中的 1647cm-1處,同時(shí)圖譜 a在1548cm-1處出現(xiàn) CNH彎曲振動(dòng)吸收峰(酰胺Ⅱ峰),這證明 NIPAAm已經(jīng)接枝到 PS上了。

圖1 PS及 P(St-g-NIPAAm)支架的紅外光譜圖

3.P(St-g-NIPAAm)支架的溫度敏感性:比較圖2中的曲線(a)、(b),P(St-g-NIPAAm)支架有一個(gè)較為明顯的吸收峰,最大的峰值即為相轉(zhuǎn)變溫度或最低臨界溶解溫度(LSCT)。因?yàn)楫?dāng)溫度低于其LCST時(shí),P(St-g-NIPAAm)會(huì)在水中高度溶脹,而當(dāng)溫度高于 LCST時(shí),P(St-g-NIPAAm)會(huì)劇烈收縮失水而發(fā)生相分離。由圖2可知,P(St-g-NIPAAm)的轉(zhuǎn)變溫度與 NIPAAm的轉(zhuǎn)變溫度很接近,在 36℃附近。

圖2 PS及 P(St-g-NIPAAm)支架的差熱分析圖

4.支架親/疏水性的判定:由圖3觀察,測(cè)定 3組數(shù)據(jù),計(jì)算得水滴與膜表面接觸角平均值(表1)為 46.9°＜90°,因此判定 PS-g-NIPAAm為親水性膜。

圖3 3次測(cè)量的 P(St-g-NIPAAm)接觸角照片

表1 P(St-g-NIPAAm)的接觸角度數(shù)(°)

5.P(St-g-NIPAAm)支架的溶脹性能:由圖4可知,P(St-g-NIPAAm)支架的溶脹比對(duì)外界操作溫度具有明顯的溫度依賴性,其突變溫度大約為34℃左右。當(dāng)支架從室溫開始升溫,在 LCST以下時(shí)發(fā)生溶脹,溶脹比較大;當(dāng)溫度超過 LCST以后,支架又收縮,使溶脹比大大減小。當(dāng)將支架從 45℃開始進(jìn)行降溫處理時(shí),溶脹比隨著溫度的降低而增大;當(dāng)溫度低于 LCST時(shí),支架的溶脹程度太大以至于無法測(cè)定。這說明這種支架的溫度響應(yīng)性是可逆的。

圖4 P(St-g-N IPAAm)支架的溶脹比圖

6.P(PS-g-NIPAAm支架的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況:圖5表明,倒置相差顯微鏡下,原代細(xì)胞貼壁前為體積較小的圓形、類圓形細(xì)胞,胞質(zhì)均勻、透亮,輪廓清晰光滑,倒置相差顯微鏡下有立體感。接種后12h,部分細(xì)胞下沉貼附于培養(yǎng)孔底,24～96h細(xì)胞繼續(xù)貼壁,數(shù)量逐漸增多。細(xì)胞為折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞。隨后細(xì)胞逐漸伸展,胞質(zhì)逐漸展開,細(xì)胞扁平變大,折光性減低,整個(gè)細(xì)胞變暗,細(xì)胞核清晰可見,位于胞質(zhì)中央。完全伸展的細(xì)胞呈扁平的卵圓形,胞核清晰,細(xì)胞大小是伸展前的 2～3倍。此階段細(xì)胞增殖不明顯,核分裂象少見。接種 5天后細(xì)胞加速增殖,核分裂象多見,細(xì)胞數(shù)量明顯增多。上皮細(xì)胞逐漸生長(zhǎng)融合成片,如鋪路石狀,細(xì)胞大小均一。原代培養(yǎng) 12天左右細(xì)胞融合(圖5、圖6)。

光學(xué)顯微鏡下,HE染色可見細(xì)胞為類圓形,胞核藍(lán)染,胞質(zhì)粉紅。細(xì)胞連接成片,呈鋪路石狀,可見各期核分裂象(圖6)。透射電鏡下,上皮細(xì)胞核大呈圓形或卵圓形,胞質(zhì)內(nèi)可見正常細(xì)胞器,胞質(zhì)內(nèi)含大量的張力纖維,呈網(wǎng)狀或束狀排列,細(xì)胞表面有許多微絨毛(圖7)。

圖7 透射電鏡觀察到的上皮細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況(×1500)

圖8表明,細(xì)胞傳代接種后第 1～4天為靜止生長(zhǎng)期,細(xì)胞黏附、伸展,增殖緩慢。隨后細(xì)胞開始增殖活動(dòng),第 6～11天處于快速生長(zhǎng)期,第 13天后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制,生長(zhǎng)速度逐漸減慢。3個(gè)培養(yǎng)皿形成克隆數(shù)分別為 10、12、14;直徑35mm培養(yǎng)皿的底面積約為 8cm2,克隆形成率(%)={[(10+12+14)/3]/(200×8)}×100=0.75%。

圖8 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

討 論

1.聚合方法:輻射聚合法是把 X射線或 γ射線等作為引發(fā)能量應(yīng)用于聚合反應(yīng),從而制得熱敏高分子膜。本實(shí)驗(yàn)中高能電子束是通過電子加速器發(fā)生的,它能將低壓交流電轉(zhuǎn)變成高壓直流電,從加速管中射出,由磁掃描器在水平方向進(jìn)行掃描,并穿過鈦窗對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行輻射加工。實(shí)驗(yàn)中選取累計(jì)照射劑量為 0.25MGy,既達(dá)到了材料接枝的要求,又不至于因過度照射而引起材料透光性的改變。

2.溫度敏感性機(jī)制:溫度敏感性水凝膠隨環(huán)境溫度的變化而發(fā)生的體積相轉(zhuǎn)變,從本質(zhì)上講是一種相分離過程,必有其特定的相變熱。本研究中,在干態(tài)的時(shí)候沒有觀察到共聚膜的相轉(zhuǎn)變峰,當(dāng)把膜重新浸入水中達(dá)到平衡時(shí),又能觀察到轉(zhuǎn)變峰,這個(gè)相轉(zhuǎn)變是由于水分子和鏈段之間的相互作用。這說明 PS-g-NIPAAm具有溫敏性,并且其溫度響應(yīng)過程完全可逆。

3.溶脹和脫溶脹機(jī)制:NIPAAm的溶脹過程是水分子向凝膠內(nèi)部擴(kuò)散與凝膠側(cè)鏈上親水基團(tuán)形成氫鍵的過程。溶脹過程實(shí)際上是兩種相反趨勢(shì)的平衡過程:溶劑滲入共聚物膜內(nèi)部使體積膨脹,從而引起三維分子網(wǎng)絡(luò)的伸展,分子鏈的伸展降低了它的構(gòu)象熵值,引起了分子網(wǎng)絡(luò)的彈性收縮力,使分子網(wǎng)絡(luò)收縮。當(dāng)這兩種相反的作用相互抵消時(shí),就達(dá)到了溶脹平衡。

4.培養(yǎng)體系:國(guó)外培養(yǎng)角化細(xì)胞多采用 3T3細(xì)胞作為滋養(yǎng)層[8～10]。3T3細(xì)胞是 Swiss鼠胚胎成纖維細(xì)胞,該細(xì)胞使用前需經(jīng)射線照射或絲裂霉素 C處理,使之失去增殖能力,但仍可成活,具同化培養(yǎng)液的能力。當(dāng)角化細(xì)胞散落在其上與之接觸后,它可促使角化細(xì)胞貼壁形成克隆。上皮細(xì)胞擴(kuò)展將3T3細(xì)胞推向一邊,隨后 3T3細(xì)胞逐漸死亡。本實(shí)驗(yàn)即利用 3T3細(xì)胞促使口腔黏膜上皮細(xì)胞貼壁,還抑制混入的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng),利于得到較純的上皮細(xì)胞。

5.培養(yǎng)基:角化細(xì)胞需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng),在培養(yǎng)體系中需提供與之共同生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞、較高的胎牛血清濃度、較高的種植密度及多種輔加成分。本實(shí)驗(yàn)采用成品角化細(xì)胞培養(yǎng)液,其中含胰島素、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等,細(xì)胞增殖較快,活力較好。

6.培養(yǎng)方法:本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法(dispase)進(jìn)行培養(yǎng)。dispase是一種快速、有效、作用溫和的分離上皮與真皮的酶。它是從多黏桿菌中提取的中性蛋白酶。在分離上皮時(shí),dispase作用于基膜,選擇性地分解纖維連接素和Ⅳ型膠原,而保存上皮細(xì)胞活力及細(xì)胞連接。與胰蛋白酶相比,dispase只是將上皮分離而不分解單個(gè)角化細(xì)胞,可在保留上皮細(xì)胞活力與連接的同時(shí)將上皮層與上皮下層自基膜處完全分離,從而可得到單一的上皮細(xì)胞,故本實(shí)驗(yàn)采用 dispase分離口腔黏膜上皮細(xì)胞與其結(jié)締組織。

7.生長(zhǎng)特性:(1)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線是觀察細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律的重要方法,一般細(xì)胞生長(zhǎng)曲線近似“S”形,在傳代后經(jīng)幾天的潛伏適應(yīng)期后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,達(dá)平臺(tái)期后生長(zhǎng)穩(wěn)定,最后逐漸衰老。圖8表明,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞第 6～11天為其快速生長(zhǎng)期,第 13天之后進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞密度趨于恒定。(2)克隆形成率:克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一[8]。通過計(jì)數(shù)克隆形成率,可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力作定量分析,了解細(xì)胞的增殖力和對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性?？寺⌒纬陕逝c眾多因素相關(guān),從培養(yǎng)條件來說,與底物、培養(yǎng)液、血清的量和質(zhì)等有關(guān),也受溫度、pH的影響。從細(xì)胞方面來說,一般原代培養(yǎng)細(xì)胞弱,傳代細(xì)胞強(qiáng);所有細(xì)胞的克隆形成率均受接種細(xì)胞密度的影響。本實(shí)驗(yàn)將體外培養(yǎng)的原代口腔黏膜上皮細(xì)胞制成分散的懸液后,以密度為 200/cm2接種到底物上時(shí),發(fā)現(xiàn)克隆形成率達(dá)到0.75%,證明體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞具有一定的增殖潛力。

由此得出如下結(jié)論:(1)采用輻照反應(yīng)將異丙基丙烯酰胺 P(NIPAAm)接枝在聚苯乙烯(PS)培養(yǎng)皿的膜表面上,制備了具有溫度敏感性的聚[苯乙烯 -g-異丙基丙烯酰胺][P(St-g-NIPAAm)]支架。(2)3T3細(xì)胞在 P(St-g-NIPAAm)上成功生長(zhǎng),并具有一定的增殖能力。

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