EGFR基因突變檢測(cè)與腫瘤指標(biāo)相關(guān)性研究

徐 琳 鄭明峰 張 稷 朱幸沨 陳 若 陸榮國(guó) 吳 波 陳靜瑜

表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種受體酪氨酸激酶。經(jīng)多種機(jī)制激活后,通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程將增殖信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核,發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活及血管生成等作用。一系列研究發(fā)現(xiàn),在某些 NSCLC亞型中,EGFR的基因突變率非常高,達(dá) 40%以上,而且這些突變均發(fā)生在 EGFR酪氨酸激酶區(qū)的 ATP結(jié)合域附近,90%位于外顯子 19和外顯子 21上,且各個(gè)位點(diǎn)突變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1]。大量的回顧性研究表明,對(duì) EGFR-TKI治療有效的 NSCLC患者的 EGFR突變率為77%,但是存在約 20%對(duì)吉非替尼敏感的 NSCLC的患者不存在 EGFR突變,提示 EGFR對(duì)吉非替尼療效是一個(gè)必不可少的因素。基因檢測(cè)指導(dǎo)使用 EGFR-TKI藥物治療非小細(xì)胞肺癌將成為今后肺癌治療的主要方向。EGFR突變基因檢測(cè)需要手術(shù)標(biāo)本,文獻(xiàn)報(bào)道,非小細(xì)胞肺癌患者,尤其是老年非小細(xì)胞肺癌患者中有 33%為Ⅰ或Ⅱ期,而僅 6%得到手術(shù)治療[2]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示提示:非小細(xì)胞肺癌患者 EGFG基因表達(dá)距腫瘤邊緣 3cm以內(nèi)癌旁組織表達(dá)較高,6cm以遠(yuǎn)的正常肺組織表達(dá)不明顯[3]。在基因靶向治療的重要性逐日突顯時(shí),對(duì)不能手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌患者如何選用分子靶向治療藥物尤為重要。大量實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)已證明[4]EGFR基因突變?cè)趤喴?、女性、非吸煙、腺癌患者中發(fā)生率較高。EGFR基因突變(此處我們選擇突變率高的外顯子 19和外顯子 21)與臨床腫瘤指標(biāo)(CEA、CA125、CA199)是否有聯(lián)系?我們選取臨床上 78例進(jìn)行手術(shù)的肺癌患者進(jìn)行分析。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本資料:2010年 1～10月期間在無(wú)錫市人民醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的 78例患者進(jìn)入本研究。標(biāo)本選擇手術(shù)標(biāo)本,使用甲醛固定液保存。其中男性 40例,女性 38例,平均 63.3歲。腺癌 63例,鱗癌 12例,大細(xì)胞癌 2例,腺鱗癌 1例。吸煙 31例,均為男性;吸煙年限均超過(guò) 30年,吸煙指數(shù)均 ＞400支/年;不吸煙者 47例,9例為男性,38例為女性。臨床分期為Ⅰ期 45例,Ⅱ期 23例,Ⅲ期 3例,Ⅳ期 7例。所有肺癌患者術(shù)前均未行化放療、分子靶向藥物治療。

2.研究方法:(1)基因組 DNA提取:新鮮腫瘤組織經(jīng) 4%中性甲醛固定 12～24h后行石蠟包埋、切片、常規(guī)蘇木素 -伊紅(HE)染色,選擇典型腫瘤細(xì)胞巢部位,以組織微陣列取直徑 2mm組織芯,排列人包含 60個(gè)組織芯的受體蠟塊,行厚4μm連續(xù)切片,應(yīng)用 PCR直接擴(kuò)增 EGFR基因第 19、2l外顯子的基因片段。擴(kuò)增片段包含外顯子及其相連的內(nèi)含子部分。PCR反應(yīng)條件為變性 95℃15min;變性 94℃ 30s,退火65℃ 30s和延伸 72℃ 1m in,35個(gè)循環(huán);最后延伸 72℃ 5min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段,通過(guò)Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)觀察 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。采用Chromas軟件分析測(cè)序圖譜,分析判斷 EGFR基因第 19、2l外顯子突變區(qū)域(表1)。(2)所有患者初入院時(shí)抽取清晨空腹靜脈血 3m l,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清癌胚抗原CEA、糖類抗原 CA 125、糖類抗原 CA 199。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:各種比較均采用卡方檢驗(yàn)。

表1 第 19、21號(hào)外顯子 PCR引物序列

結(jié) 果

1.EGFR基因突變表達(dá):78例 NSCLC患者的EGFR突變率為 55.1%,其中 16例患者發(fā)生了第 19號(hào)外顯子缺失突變,突變率為 20.5%,27例患者發(fā)生了第 21號(hào)外顯子 L858R點(diǎn)突變,突變率為 34.6%。

2.腫瘤指標(biāo)與病理表達(dá):37例 NSCLC患者 CEA表達(dá)陽(yáng)性,占 47.44%,均為腺癌。28例患者 CA125表達(dá)陽(yáng)性,占 35.90%。11例患者 CA199表達(dá)陽(yáng)性,占 14.1%。

3.EGFR突變與腫瘤指標(biāo)的相關(guān)性:37例 CEA表達(dá)陽(yáng)性者,其中EGFR陽(yáng)性率有 25例,占 67.57%。

4.統(tǒng)計(jì)分析:EGFR基因突變陽(yáng)性患者的血清腫瘤指標(biāo) CEA陽(yáng)性表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與 CA125、CA199表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 78例 NSCLC患者 EGFR基因突變與CEA、CA 125、CA 199相關(guān)性[n(%)]

討 論

EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體(ErbB)家族的一員。ErbB是一組跨膜糖蛋白,屬于 I型跨膜酪氨酸激酶家族,是將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)的重要途徑,其功能的發(fā)揮需要與相應(yīng)的配體結(jié)合,從而調(diào)控正常細(xì)胞的增殖、分化。EGFR蛋白由定位于人類染色體7p11-13上的 HER-1基因編碼,為Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體,相對(duì)分子質(zhì)量 70×103kDa,定位于細(xì)胞膜上,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū) 3部分組成,廣泛分布于除血管以外的上皮細(xì)胞膜上。目前的大量研究顯示:NSCLC患者 EGFR的突變均發(fā)生在酪氨酸激酶域 ATP結(jié)合域附近(第 18～21外顯子),表現(xiàn)為 1個(gè)或一段堿基的缺失、插入以及堿基替換引起的錯(cuò)義突變,這些突變可以引起酪氨酸激酶的活性增強(qiáng)[5]。Scorpions ARMS檢測(cè)到 42例突變,其中90%以上突變發(fā)生在第 19和 21外顯子。Pao等[6]研究表明第 19外顯子多個(gè)核苷酸框架缺失突變,位于 EGFR TK活化部位,都包含共同的堿基序列缺失(第 747～750個(gè)密碼子),分別編碼亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸(LREA),這一序列在脊椎動(dòng)物中高度保守,說(shuō)明它在 EGFR功能中起重要作用。第 21外顯子點(diǎn)突變位于 EGFR TK活化環(huán)高度保守區(qū)附近,使 858位上亮氨酸被精氨酸替代(L858R)。本試驗(yàn) EGFR檢測(cè)與既往結(jié)果一致。

癌胚抗原(carcinoecmbryonic antigen,CEA)屬于細(xì)胞表面的糖蛋白家族,這一家族基因位于 19號(hào)染色體,可分泌 36種不同的糖蛋白,最主要的一種即CEA。CEA存在于細(xì)胞膜上屬于免疫球蛋白超家族成員中的細(xì)胞黏附分子,具有同嗜和異嗜黏附功能,在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能起重要作用[7]。Plavec等測(cè)定的73例原發(fā)性肺癌患者術(shù)前血清 CEA值,陽(yáng)性率為60%,其中腺癌的陽(yáng)性率達(dá) 87.9%,鱗癌與 SCLC的陽(yáng)性率分別為25.9%和13.3%,特異性為 99%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97%。顯示 CEA對(duì)診斷腺癌的臨床價(jià)值較大。而 CA是由一組糖基轉(zhuǎn)移酶綜合作用產(chǎn)生的基因產(chǎn)物,當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí),腫瘤糖類抗原能從各種不同組織或轉(zhuǎn)移癌中分離出來(lái),而正常的組織則不存在。

本研究 78例肺癌患者中,EGFR基因突變陽(yáng)性與血清腫瘤指標(biāo) CEA表達(dá)陽(yáng)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與 CA125、CA199表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們考慮肺腺癌患者血清 CEA陽(yáng)性表達(dá)率高,與肺腺癌患者 EGFR基因突變率高相一致,通過(guò)本研究,EGFR基因突變陽(yáng)性與血清腫瘤指標(biāo) CEA表達(dá)陽(yáng)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。因而對(duì)不能進(jìn)行手術(shù)治療獲取手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行 EGFR基因檢測(cè)時(shí),我們選擇腫瘤指標(biāo)表達(dá)CEA陽(yáng)性的 NSCLC患者接受 EGFR-TKI行一線治療,或者化療后序貫給予 EGFR-TKI維持治療或者化療間期間斷給予 EGFR-TKI交替給藥方案可能會(huì)取得更好的療效。是否與腫瘤患者的預(yù)后有一定的相關(guān)性,為化療后序貫靶向治療提供一定的依據(jù),尚待進(jìn)一步研究。

1 Chan SK,GullickWJ,HillME.Mutations of theepidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer search and destroy.Eur JCancer,2006,42(1):17-23

2 Dexter EU,Jahangir N,Kohman LJ.Resection for lung cancer in the elderly patient.Thorac SurgClin,2004,14(2):163-171

3 Sequist LV,Bell DW,Lynch TJ,et al.Molecular predictors of response toepidermal growth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer.JClin Oncol,2007,25(5):587-595

4 Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activatingmutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.NEngl JMed,2004,350(21):2129-2139

5 Paez JG,Janne PA,Lee JC,et al.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science,2004,304(5676):1497-1500

6 PaoW,Miller V,ZakowskiM,et al.EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from"never smokers"and are associated with sensitivity of tumors to gdltinib and erlotinib.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(36):13306-13311

7 Salgia R,Harpole D,Herndon JE,et al.Role of serum tumor markers CAl25 and CEA in non-small cell lung cancer,Anticancer es,2001,21(2B):1241-1246