醋酸配伍前后生脈散中多糖含量的變化

傅華洲 李偉平 朱學(xué)鑫 蔣福升 丁志山

生脈散由人參、麥冬和五味子組成,具有生津止渴、益氣養(yǎng)陰、固表止汗等功效,在臨床上得到了廣泛的使用,尤其是對于心血管疾病,療效確切[1]。與人參麥冬組成的參麥方劑相比,生脈散往往具有更強的療效。楚延等研究發(fā)現(xiàn)生脈注射液增強實驗動物非特異性免疫功能和心肌細胞耐缺氧能力明顯優(yōu)于參麥注射液。有報道稱生脈注射劑對非特異性炎癥具有顯著的抗炎作用,而參麥注射液則無此作用[2]?？梢?五味子配伍對參麥的藥效具有顯著的影響。在中醫(yī)方劑中常常見到含酸性成分中藥和含堿性成分中藥同處一方配伍應(yīng)用的情況,這些配伍往往能對方劑的化學(xué)成分和藥效產(chǎn)生一定的影響[3]。五味子中含有大量的五味子酸,它的配伍是不是五味子酸在起酸堿藥對的作用。為對此進行研究,本研究用 HAC代替五味子來研究五味子中的有機酸在配伍中是否起到作用。多糖是生脈散中重要組成成分之一,具有多種藥理學(xué)活性。為探討生脈散全方獨特療效的物質(zhì)基礎(chǔ),本研究采用硫酸苯酚法分別對人參麥冬水煎液、人參麥冬配伍五味子后的水煎液、五味子水煎液和人參麥冬與 5%HAC共煎液中的多糖含量進行了測定。

材料與方法

1.實驗主要材料和試劑:麥冬(產(chǎn)地:遼寧,浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠);五味子(產(chǎn)地:浙江,浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠);硫酸(分析純,杭州大方化學(xué)試劑廠);苯酚(分析純,杭州大方化學(xué)試劑廠);乙腈(色譜純,臨海市浙東特種試劑廠);甲醇(分析純,浙江杭州大方化學(xué)試劑廠)。

2.實驗主要儀器設(shè)備:電熱恒溫水浴鍋(DK-S24上海森信實驗儀器有限公司);LDZ5-2低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠);S54紫外可見分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司);UV 8500紫外分光光度計(上海天美光學(xué)儀器有限公司);R-201旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司);電子精密天平(AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook,NJ,USA)。

3.實驗方法:(1)供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:1)供試品溶液的制備:按以下配方稱好藥材:A生脈散組:人參 2g,麥冬 4g,五味子 2g;B參麥組:人參 2g,麥冬 4g;C五味子組:五味子 2g;D參麥加 HAC組:人參 2g,麥冬 4g。上述藥材稱好后,A、B、C均加 10倍量水提取 3次,D加 10倍量的 5%HAC溶液提取 3次,每次提取時間為 1h,合并 3次過濾液,4℃保存?zhèn)溆肹4]。2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:稱取干燥至恒重的葡萄糖 20.4mg,用蒸餾水定容到 100ml,即得 0.2mg/ml的葡萄糖溶液,4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)測定波長的選擇:取 0.2mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液,稀釋 4倍。精密吸取 0.2ml,加入 5%的苯酚 0.2ml,立即搖勻,然后加入 1m l的濃 H2SO4,振搖 5min,置沸水浴中15min,再冷水浴 10min,備用。同時取 A供試品溶液,分別加蒸餾水稀釋 800倍,精密吸取 0.2ml,加入 5%的苯酚 0.2ml,立即搖勻,然后加入 1ml的濃 H2SO4,振搖 5min,置沸水浴中15min,再冷水浴 10min。以蒸餾水替代糖溶液,如上法配制空白。然后紫外做全波長掃描。

(3)顯色條件的選擇:以顯色劑 5%苯酚用量,硫酸用量及反應(yīng)時間為考察因素,采用正交設(shè)計考察顯色條件。因素與水平見表1。

各組反應(yīng)完全后,490nm測定吸光度。分析最佳的顯色劑加入量。

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:取 0.2mg/ml的葡萄糖溶液,分別取 250μl、500μl、750μl、 1000μl、 1250μl、 1500μl、1750μl、2000μl。稀釋到 3ml,取 0.4m l加入 5%苯酚 0.4ml和濃H2SO42ml反應(yīng)適當(dāng)時間后,在 490nm測定吸光度,以吸光度為橫坐標(biāo),葡萄糖濃度 (mg/ml)為縱坐標(biāo),制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(5)換算系數(shù)的測定:精確量取供試樣品溶液適量,加水稀釋后,精確吸取 0.4m l,照“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項下方法測定吸收度,從回歸方程求出多糖供試液中葡萄糖濃度C,按下式計算換算系數(shù) f=W/CD,式中:W為樣品多糖重量(μg),C為多糖溶液中葡萄糖的濃度(μg/m l),D為多糖的稀釋倍數(shù)。

(6)方法學(xué)考察:①精密度考察:精密量取 A供試品溶液適量,共 6份,稀釋 800倍后,取 0.4ml加入 5%苯酚 0.4ml和濃H2SO42ml,490nm測定吸光度,考察實驗方法的精密度;②穩(wěn)定性考察:精密吸取 A樣品溶液,稀釋800倍后,取 0.4m l加入 5%苯酚 0.4m l和濃 H2SO42ml,每隔 30m in測定吸光度,共測定 3次,考察其在 90m in內(nèi)的穩(wěn)定性;③加樣回收試驗:精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量,加入到已知濃度的 A供試品溶液中按樣品測定同樣的方法進行測定,按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法測其吸光度值,按以下公式計算回收率,考察測定方法的準(zhǔn)確度?；厥章?=(實驗測值-樣品所含被測成分量)/加入標(biāo)準(zhǔn)品量 ×100%。

(7)樣品中多糖含量的測定:各樣品按照上述的方法加入硫酸和苯酚,490nm測定吸光度,然后按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣方法測吸光度值,按下式計算多糖含量:多糖含量(%)=CDf/W×100%。式中:W為樣品多糖重量(μg),C為多糖溶液中葡萄糖的濃度(μg/ml),D為多糖的稀釋倍數(shù),f為換算系數(shù)。

結(jié) 果

1.紫外全波長掃描結(jié)果:全波長掃描結(jié)果見圖1。通過全波長掃描,發(fā)現(xiàn)樣品在 490nm有最大吸收峰,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在 488nm有最大吸收峰。兩者相差僅 2nm。結(jié)合硫酸苯酚法的原理:糖在濃硫酸作用下,脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物,在線性范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量呈正比,且在 490nm附近波長下有最大吸收峰,故本實驗選擇 490nm為測定波長。

圖1 全波長掃描圖

2.顯色條件選擇:顯色劑考察結(jié)果見表2(n=3,平均RSD=2.01%):

表2 L 9(33)正交設(shè)計顯色結(jié)果

分析數(shù)據(jù)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)對顯色影響最大的因素是硫酸的加入量,其次是苯酚的加入量。最佳的顯色條件是 A1B1C3,即加入 0.5倍的苯酚,5倍的硫酸,沸水中反應(yīng)時間為 30min。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線:結(jié)果發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=6.9985X+0.0197,R2=0.9989。葡萄糖在 0.017～0.136mg/ml范圍內(nèi)吸光度與葡萄糖加入量線性關(guān)系良好(圖2)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

4.方法學(xué)考察結(jié)果及醋酸配伍前后生脈散中多糖含量的變化:本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),用硫酸苯酚法來測定生脈散中多糖含量,測定方法準(zhǔn)確可靠,平均回收率為 98.15%,RSD=3.22%(n=6)。實驗研究結(jié)果表明,生脈散配伍前后,多糖含量有明顯的變化。生脈散中多糖的含量較高,但生脈散中配伍五味子后,多糖的含量下降了 4.7%。用 HAC代替五味子后,多糖的含量下降了 15.4%,具體見表3。

表3 多糖含量測定結(jié)果

討 論

中藥配伍應(yīng)用是中醫(yī)用藥的基本形式,中藥復(fù)方的作用不同于單味藥的簡單加和,傳統(tǒng)的煎煮過程中成分的改變對復(fù)方的整體療效是有利的[5]。復(fù)方在煎煮中發(fā)生了復(fù)雜的物理和化學(xué)變化,強化對組分之間相互作用的研究有助于深化對中藥藥理認(rèn)識,因此通過研究配伍前后化學(xué)成分的變化時研究中藥配伍規(guī)律的重要手段。生脈散由人參、麥冬和五味子組成,是中醫(yī)治療氣陰兩虛證的基本方,成分較為復(fù)雜,主要含皂苷和多糖等成分。研究者對其配伍后各化學(xué)成分的變化的研究也取得了一定的進展。

目前有研究表明,生脈散全方在煎煮過程中人參皂甙發(fā)生了水解變化,麥冬、五味子與人參配伍都能對人參皂甙的含量產(chǎn)生影響[6]。但是,目前尚未見有關(guān)研究生脈散配伍前后多糖含量變化的報道,多糖是生脈散水煎液中重要組成成分,兼具有人參多糖、麥冬多糖和五味子多糖各自活性作用,同時還具有 3種多糖的配伍協(xié)調(diào)作用,療效顯著,作用機制復(fù)雜[7]。本研究探討了五味子配伍前后生脈散復(fù)方中多糖類成分的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)配伍五味子后,生脈散中多糖的含量有所下降,這表明在生脈散的煎煮過程中,五味子一定程度上抑制了生脈散多糖的煎出或促進了多糖的轉(zhuǎn)化。呂惠卿等[8].也報道稱五味子配伍麥冬后使麥冬水提液多糖含量明顯減少,這與本研究的結(jié)果是一致的。本實驗可以為進一步揭示生脈散的配伍規(guī)律提供實驗依據(jù)。

從酸性化學(xué)成分類角度探討方劑藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律具有重要的意義。有研究者[9]在實驗中以 5%HAc,50%HAc溶液與人參配伍,觀察酸性條件下人參皂苷的變化,發(fā)現(xiàn)以 HAc代替五味子進行煎煮,人參皂苷的變化結(jié)果與人參、五味子配伍情況相一致。該研究表明酸性在生脈散煎煮過程中起重要的作用,故本實驗對醋酸代替五味子配伍后對生脈散復(fù)方中多糖類成分的變化進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用 HAc代替五味子進行煎煮后,生脈散復(fù)方中多糖的含量變化趨勢與用五味子配伍情況相一致,通過本研究可以推斷五味子配伍前后引起生脈散中多糖類成分的變化可能是由于五味子酸引起的。有研究表明[10],生脈散復(fù)方中五味子配伍后將產(chǎn)生 5-羥甲基 -2-糠醛(5-HMF),5-HMF是糖在高溫或酸性等條件下脫水形成的醛類化合物[11],在本實驗中發(fā)現(xiàn),在五味子和 HAC配伍后,生脈散中的多糖含量下降,結(jié)合文獻[10]五味子酸能促進生脈散中 5-HMF的形成,我們推斷五味子和 HAC配伍后,五味子酸的酸性以及 HAC的酸性促使生脈散中的多糖類成分轉(zhuǎn)化成了 5-HMF,但這還需要進一步的研究來證實。

1 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典 2010版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:653

2 張燕,楊曉林.試述生脈注射液與參麥注射液的區(qū)別.實用中醫(yī)藥雜志,2008,24(10):683

3 裴妙榮,王世民,張淑蓉,等.“酸堿對藥”在方劑中的配伍化學(xué)研究新思路,中國中醫(yī)藥科技,2007,14(5):357-358

4 張加雄,王凌.生脈散配方顆粒的提取工藝研究.西南國防醫(yī)藥,2010,20(4):359-361

5 李偉東,蔡寶昌.中藥復(fù)方化學(xué)研究思路與方法.美中醫(yī)學(xué),2006,3(4):6-9

6 裴妙榮.中醫(yī)方劑化學(xué).中國中醫(yī)藥出版社,2008:260-276

7 胡聞莉,劉文英,吳春勇,等.生脈散多糖的組成及其初級結(jié)構(gòu)分析.中國藥科大學(xué)學(xué)報,2002,33(1):38-41

8 呂惠卿.麥冬與不同藥味配伍水提液中多糖含量的測定.中國中醫(yī)藥科技,2006,14(1):5

9 朱丹妮,嚴(yán)永清,李志明.生脈散復(fù)方化學(xué)動態(tài)變化與藥效關(guān)系的研究——生脈散復(fù)方化學(xué)的研究(Ⅲ).中國中藥雜志,1998,23(8):483-486

10 朱丹妮李志明 嚴(yán)永清生脈散復(fù)方化學(xué)動態(tài)變化與藥效關(guān)系的研究——生脈散復(fù)方化學(xué)的研究(Ⅱ).中國中藥雜志,1998,23(5):291-292

11 周福富,廖愛國,劉風(fēng)景,等.不同因素對 5-羥甲基糠醛含量的影響.中國藥業(yè),2008,17(19):44-45