實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)人半翼基因在宮頸病變中的表達(dá)及意義

盧博奇，藺 莉

宮頸癌是婦科疾病中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年有近30萬(wàn)新發(fā)宮頸癌病例，總體5年生存率約為52%。發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)每年約有1萬(wàn)例宮頸癌新發(fā)病例，而中國(guó)每年約有8～10萬(wàn)例宮頸癌新發(fā)病例，死亡率位居中國(guó)女性癌癥的第二位［1］。宮頸癌近年來(lái)呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，但很多研究證明99%的宮頸癌組織中可檢出人乳頭瘤病毒(HPV)。目前普遍接受的觀點(diǎn)是:HPV是宮頸癌的主要致病因子［2－3］。然而在感染 HPV的婦女中，大多數(shù)可自行消退，僅少數(shù)婦女發(fā)展為持續(xù)性感染并進(jìn)展為宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(CIN)甚至宮頸癌。但宮頸癌患者并非都有HPV的感染，說(shuō)明在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中，還有其他一些因素發(fā)揮作用［4］。人半翼 (hWAPL)基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與宮頸癌及HPV關(guān)系十分密切的一個(gè)基因［5－6］，研究表明hWAPL基因在宮頸癌中特異性高表達(dá)［6］。本研究在分子水平上采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)測(cè)定宮頸中hWAPL基因的表達(dá)水平，探討hWAPL基因表達(dá)與宮頸病變之間的關(guān)系，為探索宮頸癌的早期診斷方法提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2007年3月—2009年1月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院門(mén)診行陰道鏡檢查、取材并經(jīng)病理檢查證實(shí)的宮頸病變標(biāo)本共100例，患者均未經(jīng)任何物理、化學(xué)、放射治療及手術(shù)治療，包括慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌各20例。病理結(jié)果均由北京友誼醫(yī)院病理科證實(shí)。陰道鏡下取材的宮頸組織先保存于液氮中，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 總RNA提取 每個(gè)樣本取凍存組織50～100 mg，使用總RNA提取試劑盒〔天根生化科技 (北京)有限公司〕，用離心柱法進(jìn)行總RNA提取。將RNA在1%瓊脂糖中進(jìn)行電泳檢測(cè)其完整性，可見(jiàn)28S及18S兩條清晰條帶。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Gene bank中hWAPL基因及β－actin基因 (看家基因)序列，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下:hWAPL基因上游為GATAAGAGTGGAGAGTGGCAA，下游為ACCCAAGAAGTAGTGCTGTGT，產(chǎn)物長(zhǎng)度194 bp;β－actin基因上游為T(mén)CAAGATCATTGCTCCTCCTG，下游為T(mén)CATAGTCCGCCTAGAAGCAT，產(chǎn)物長(zhǎng)度160 bp。

1.2.2.2 cDNA第一鏈的合成 使用美國(guó)Promega公司MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，建立25 μl反應(yīng)體系:M－MLV 5×緩沖液5 μl，dNTP混合物 (10 mM)3 μl，RNasin核糖核酸酶抑制劑1 μl，M － MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，Poly(T) 引物 (10 μM)1 μl，總 RNA(1 μg/μl)1 μl，RNase － free H2O 13 μl; 反應(yīng)條件:25℃ 5 min，37℃ 1 h，95℃ 10 min。cDNA用于PCR反應(yīng)或保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 為校正定量過(guò)程中不同樣品RNA中mRNA含量的差異，選用β－actin基因作為內(nèi)參照對(duì)RNA含量的變異進(jìn)行校正。以cDNA為模板，β－actin基因?yàn)橐镞M(jìn)行擴(kuò)增，β－actin基因 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接轉(zhuǎn)化、提質(zhì)粒，并對(duì)β－actin基因質(zhì)粒原液進(jìn)行定量，將此質(zhì)粒原液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線中最高的模板 (1011拷貝)，然后將其逐次10倍稀釋成1010、109、108、107、106、105、104和 103用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

采用SYBR GreenⅠ熒光染料摻入法，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品做兩個(gè)平行，并設(shè)有雙蒸水空白對(duì)照。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 使用美國(guó)ABI公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，采用總體積15 μl反應(yīng)體系:SYBR Green Master Mix 7.5 μl，去離子水 4.5 μl，上游引物 1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl。反應(yīng)條件:25 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β－actin基因作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增完成后，采用計(jì)算機(jī)軟件 (7300 System Software Applied Biosystem)分析各反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，得出反應(yīng)的臨界循環(huán)數(shù) (CT)值并自動(dòng)繪制β－actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出目的基因的相對(duì)反應(yīng)起始拷貝數(shù)。hWAPL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=hWAPL基因拷貝數(shù)/β－actin基因拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 hWAPL基因在慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組中均有表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄合成的特異性hWAPL基因cDNA經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在194 bp處有清晰條帶 (見(jiàn)圖1)。

圖1 逆轉(zhuǎn)錄合成hWAPL基因的cDNA PCR擴(kuò)增電泳圖Figure 1 Electrophoresis of cDNA PCR amplification for Reverse transcription hWAPL

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

2.2.1 慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組中hWAPL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增多，5組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=9.47，P=0.00)。其中CINⅢ組和宮頸癌組與慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，慢性宮頸炎組、CINⅠ組和CINⅡ組hWAPL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于宮頸癌組和宮頸癌組;宮頸癌組與CINⅢ組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 宮頸組織hWAPL mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

表1 宮頸組織hWAPL mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

注:*與CINⅢ組和宮頸癌組比較，P＜0.01;△與宮頸癌組比較，P＞0.05

mRNA慢性宮頸炎組 20 1.05±0.68組別 例數(shù) hWAPL基因*CINⅠ組 20 3.05±1.57*CINⅡ組 20 4.48±2.25*CINⅢ組 20 8.71±7.70△宮頸癌組 20 10.49±9.82

2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和融解曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)0.996，＞0.99，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)有5個(gè)，融解曲線顯示只有一個(gè)大峰，沒(méi)有引物二聚體。均證明引物設(shè)計(jì)準(zhǔn)確，特異性好，產(chǎn)物擴(kuò)增效率良好，定量結(jié)果可靠 (見(jiàn)圖2～4)。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve

圖3 hWAPL融解曲線Figure 3 hWAPL dissociation curve

圖4 β－actin融解曲線Figure 4 β－actin dissociation curve

3 討論

半翼 (WAPL)基因是1977年發(fā)現(xiàn)的果蠅體內(nèi)的X連鎖基因序列［7］，是果蠅體內(nèi)調(diào)節(jié)異染色質(zhì)組織的基因產(chǎn)物。hWAPL基因是果蠅體內(nèi)WAPL基因在人體內(nèi)的同源序列，定位于10q23.2，編碼一種聚合錨定蛋白，有利于其在分裂前期適時(shí)從染色體臂解離。Hela細(xì)胞中WAPL基因的缺失導(dǎo)致分裂前中期同源染色體細(xì)胞瞬間聚集，其中兩個(gè)姐妹染色單體的解離存在嚴(yán)重的缺陷。當(dāng)兩個(gè)姐妹染色單體彼此聚合的時(shí)候，染色質(zhì)中心軸的聚合蛋白呈現(xiàn)高水平。聚合蛋白的減少減輕了WAPL基因缺失表型，并且使人動(dòng)點(diǎn)蛋白 (Sgo1)和粘連蛋白(Esco2)缺失的細(xì)胞中過(guò)早分離的姐妹染色單體還原［8］。相反的，WAPL基因的過(guò)度表達(dá)反而使姐妹染色單體過(guò)早解離，并且擾亂有絲分裂和胞質(zhì)分裂，從而誘導(dǎo)染色體的不穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤的形成［5－9］。Oikawa等［10］從良性宮頸上皮、宮頸非典型增生上皮和浸潤(rùn)性宮頸癌中分離出并確定了WAPL突變型，并利用Northern印跡技術(shù)對(duì)宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌及其相應(yīng)的正常組織中的hWAPL基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他癌組織及其相應(yīng)的正常組織，宮頸癌中hWAPL基因mRNA表達(dá)升高十分明顯［5］。利用免疫組化技術(shù)對(duì)正常宮頸上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中hWAPL的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)hWAPL基因在所有檢測(cè)的標(biāo)本中均有表達(dá)，但在正常宮頸上皮中的表達(dá)僅限于基底層;在CINⅠ～Ⅲ級(jí)和宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸增加。

Oikawa等［5］還用血凝素 (HA)標(biāo)記的hWAPL表達(dá)載體(HA－h(huán)WAPL 3T3)或HA表達(dá)載體 (HA－3T3)轉(zhuǎn)染宮頸癌NIH3T3細(xì)胞，然后比較HA－h(huán)WAPL 3T3和HA－3T3細(xì)胞在裸鼠中生成腫瘤的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有注射HA－h(huán)WAPL 3T3細(xì)胞的裸鼠均在注射10 d后有腫瘤生成，而在HA－3T3注射的裸鼠體內(nèi)無(wú)一例發(fā)生腫瘤，表明hWAPL具有癌基因的特征。

曹利仙等［11］在hWAPL基因序列中選取了兩處作為干擾靶點(diǎn)，將含9個(gè)堿基環(huán)結(jié)構(gòu)的退火雙鏈與含U6啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體相連，成功構(gòu)建針對(duì)WAPL基因的shRNA長(zhǎng)效真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定表明成功構(gòu)建了3個(gè)pGenesilhwAPL－shRNA，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，篩選到的短鏈WAPL基因siRNA能有效抑制內(nèi)源hWAPL基因的表達(dá)。說(shuō)明該shRNA真核表達(dá)載體能特異地降低宮頸癌CaSki細(xì)胞hWAPL基因mRNA水平，起到轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用，抑制宮頸癌細(xì)胞惡性增殖。

本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中hWAPL基因mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明，在所有實(shí)驗(yàn)組中均有hWAPL基因mRNA表達(dá)，并且隨著宮頸病變程度的加重，hWAPL基因mRNA表達(dá)量逐漸上升，在宮頸癌組中的表達(dá)明顯高于宮頸炎組、CINⅠ組和CINⅡ組，說(shuō)明hWAPL基因在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著極其重要的作用。本研究結(jié)果顯示，CINⅢ組和宮頸癌組中hWAPL基因mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異，但在臨床的診療中，CINⅢ和宮頸癌的治療方法的選擇和隨訪均有較大的差別，能否將hWAPL基因mRNA表達(dá)量的高低作為判斷宮頸病變程度的可靠指標(biāo)，仍需進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)，hWAPL基因在宮頸癌中的具體作用機(jī)制將成為以后研究的主要任務(wù)。

1 黃莫婉，馬英.宮頸癌研究新進(jìn)展 ［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35(23):2185－2187.