Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

晏 淼，朱正秋，卞保祥，鄭義同

胃癌的死亡率在世界范圍內(nèi)居高不下，主要原因之一是胃癌的治療進(jìn)展緩慢，手術(shù)、放療及化療均不能取得滿意效果，最終死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。自從靶向治療問(wèn)世后，獲得了學(xué)者的廣泛關(guān)注，也取得了不錯(cuò)的效果。目前，信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的缺陷和異常活化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系已成為腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，通過(guò)干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑治療也成為生物治療的新興領(lǐng)域。在這些信號(hào)傳導(dǎo)通路中，Akt/mTOR信號(hào)通路是關(guān)鍵的細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通道之一，其活性的明顯增強(qiáng)與許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用PV－9000二步法免疫組化檢測(cè)Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理特征進(jìn)行探討，以期為下一步臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn) (1)組織病理學(xué)診斷結(jié)果經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確診為胃癌，胃癌的組織學(xué)類型以世界衛(wèi)生組織(WHO)分類2000為準(zhǔn);(2)有明確的胃癌TNM分期和組織學(xué)分級(jí)，以美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì) (AJCC)2010年第7版為準(zhǔn);(3)行根治性手術(shù);(4)術(shù)前均未經(jīng)放療或化療。

1.2 標(biāo)本 收集2009年9月—2010年9月連云港市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌蠟塊標(biāo)本93例 (實(shí)驗(yàn)組)，病例均符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)。其中男67例，女26例;年齡26～83歲，平均61歲。從93例患者中隨機(jī)抽取40例，取其癌旁組織 (距腫瘤組織邊緣5 cm以上)作為對(duì)照組，其中男26例，女14例;年齡36～79歲，平均61歲。

1.3 主要試劑及方法 兔抗人多克隆抗體p－Akt、兔抗人單克隆抗體p－mTOR、PV－9000檢測(cè)試劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用PV－9000二步法免疫組化檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書嚴(yán)格操作，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。必須同時(shí)滿足以下條件才能判斷為陽(yáng)性，否則為陰性:(1)陽(yáng)性細(xì)胞定位明確;(2)間質(zhì)清晰、無(wú)背景著色;(3)陽(yáng)性細(xì)胞占5%以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS l7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，并行Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p－Akt、p－mTOR在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)p－Akt、p－mTOR這兩種蛋白陽(yáng)性信號(hào)主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。p－Akt、p－mTOR在實(shí)驗(yàn)組的胃癌組織和對(duì)照組的癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 p－Akt、p－mTOR的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系93例患者分別按年齡、性別、病理分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期分組，分別統(tǒng)計(jì)組間p－Akt、p－mTOR的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，不同分化程度、侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期組組織中p－Akt、p－mTOR的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而在年齡、性別不同分組中的表達(dá)間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)表2)。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中p－Akt、p－mTOR的表達(dá)［n(%)］Table 1 Expression of p－Akt and p－mTOR in the observed group and the control group

表2 p－Akt、p－mTOR陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2 Correlations between positive expression of p－Akt and p－mTOR and clinicopathologic features of gastric carcinoma

2.3 p－Akt與p－mTOR在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織中p－Akt蛋白表達(dá)與pmTOR蛋白表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.327，P＜0.01，見(jiàn)表3)。

表3 93例胃癌組織中p－Akt、p－mTOR的表達(dá) ［n(%)］Table 3 Expression of p－Akt and p－mTOR in 93 gastric carcinomas specimens

3 討論

3.1 Akt/mTOR信號(hào)通路是關(guān)鍵的細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通道之一，其活性增強(qiáng)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。Akt又被稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在著3種Akt異構(gòu)體 (Akt 1～3)，這3種由不同基因編碼的蛋白擁有80%的序列一致性，并且功能大部分相同。Akt通過(guò)殘基Thr308和Ser473的磷酸化而被激活，Akt的活性在多種惡性腫瘤中被放大，其異常激活意味著腫瘤細(xì)胞對(duì)于凋亡誘導(dǎo)的耐受，細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、代謝的異常增加。有研究發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化主要發(fā)生在胃癌，激活后能延長(zhǎng)細(xì)胞的生存壽命和增加細(xì)胞的增殖，進(jìn)而促使腫瘤發(fā)展和血管生成［2］。磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol－3－kinase，PI3K) 抑制劑 LY294002能抑制Akt的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期停滯。因此，Akt不僅是一個(gè)有活性的激酶，并且能促進(jìn)胃癌的發(fā)展和增殖。Paweletz等［3］檢測(cè)疾病發(fā)展中的分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)從正常細(xì)胞到不典型增生再到惡性轉(zhuǎn)化，Akt的激活水平漸次增加，而且伴隨凋亡相關(guān)分子標(biāo)志物丟失，支持Akt在腫瘤發(fā)展中提高腫瘤生存能力的理論。周詩(shī)瓊等［4］研究發(fā)現(xiàn)早期胃癌、中晚期胃癌的癌組織中Akt蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均較正常胃黏膜組織高，差異有顯著性。

本研究結(jié)果顯示，p－Akt在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為54.8%(51/93)，較癌旁組織 (2.5%)高;低分化及未分化(G3+G4)的胃癌組織中p－Akt陽(yáng)性表達(dá)率高于高、中分化(G1+G2)組織，侵犯深度為穿透漿膜層 (T4)的組織p－Akt陽(yáng)性表達(dá)率高于未穿透 (T1+T2+T3)的組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N1+N2+N3)的胃癌組織p－Akt陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (N0)的組織，TNM分期為Ⅲ期和Ⅳ期的高于Ⅰ期和Ⅱ期的。p－Akt蛋白的表達(dá)與胃癌細(xì)胞的分化程度有關(guān)，可能是因?yàn)锳kt蛋白的過(guò)度擴(kuò)增促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、進(jìn)展。隨著腫瘤侵犯突破漿膜層、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期的提高，p－Akt蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率增高，提示p－Akt蛋白的表達(dá)促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是Akt通過(guò)激活其底物來(lái)增加細(xì)胞周期素 (cyclin)D轉(zhuǎn)錄，還可以通過(guò)磷酸化p2lCIPI使細(xì)胞周期加速，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。

3.2 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個(gè)非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其C末端與PI3K的催化結(jié)構(gòu)域高度同源，因此也屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白家族。mTOR可以整合氨基酸、能量、生長(zhǎng)因子所激發(fā)的信號(hào)通路，借以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和細(xì)胞周期，通過(guò)控制其下游與翻譯、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的多種蛋白的磷酸化來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)和增殖中起中心調(diào)控作用，其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)通路異常與多種腫瘤的形成密切相關(guān)［5］。Lang等［6］研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在胃癌組織中表達(dá)升高，且雷帕霉素可抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷徙，并抑制小鼠胃癌生長(zhǎng)。孫丹鳳等［7］研究也發(fā)現(xiàn)雷帕霉素干預(yù)后可使胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，隨著時(shí)間的增加抑制效應(yīng)更顯著，證實(shí)mTOR信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞中也發(fā)生改變，可能成為一種潛在的治療靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p－mTOR在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為57.0%(53/93)，顯著高于癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率(2.5%)，提示這種蛋白可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。而且pmTOR的表達(dá)與腫瘤侵犯深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)。結(jié)果表明，p－mTOR的陽(yáng)性表達(dá)率隨著胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等進(jìn)展而上調(diào)，提示他們可能參與了胃癌的發(fā)生以及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，mTOR通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)鏈而作用于細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)翻譯等細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

此外，本研究中Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織中p－Akt蛋白表達(dá)與p－mTOR蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，可能的原因是它們?cè)谖赴┑陌l(fā)生、發(fā)展中存在著協(xié)同作用。

3.3 隨著人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞癌變的本質(zhì)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞無(wú)限增殖，隨之而來(lái)的就是抗腫瘤藥物研發(fā)焦點(diǎn)正在從傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)移到針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)系統(tǒng)靶點(diǎn)的特異性的抗腫瘤藥物［8］。本實(shí)驗(yàn)也為Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的相關(guān)抑制劑有望成為胃癌新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。Akt抑制劑哌立福新 (perifosine)、mTOR的抑制劑雷帕霉素及其類似物依維莫司 (RAD001)、CCI779、AP23573等已經(jīng)分別進(jìn)入各期臨床研究［9－11］。其中，RAD001在既往化療失敗的轉(zhuǎn)移性胃癌中應(yīng)用的Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，令人期待［12］。Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望成為預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移的新分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

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