蹄葉橐吾組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究

高國超，黃 楠，廖 萍，徐 娜，姜長陽

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116029）

蹄葉橐吾（Ligularia fischeri）又稱山紫苑、葫蘆七、荷葉七、硬紫苑、馬蹄紫苑、土紫苑和水荷葉等，屬于菊科橐吾屬多年生草本植物[1]，生長于濕地、山坡草地、河岸、灌叢和林下，在我國，主要分布在東北、華北等地，在遼寧的撫順、清原、寬甸、桓仁、岫巖、本溪、瓦房店、普蘭店等地有種植[2]。蹄葉橐吾的根和根莖含有倍半萜類化合物[3-6]，具有祛痰止咳、活血止疼、補(bǔ)虛潤肺等功效，能治咳嗽、痰多、咽痛、咳血、肺結(jié)核、勞傷、跌打損傷等疾病[6]。由于蹄葉橐吾具有重要的藥用價(jià)值。多年來，人們一直大量的采挖作為藥材，這使本來分布和數(shù)量較少的野生蹄葉橐吾越來越少。蹄葉橐吾利用種子繁殖較難，人工種植難度大。為了開發(fā)利用蹄葉橐吾這一寶貴資源，解決種植所需種苗問題，人們試圖探討無性系組培技術(shù)應(yīng)用的可能性。雖然目前國內(nèi)已有蹄葉橐吾組織培養(yǎng)研究的報(bào)道[7-8]，但迄今未見有關(guān)蹄葉橐吾快速繁殖研究的報(bào)道，為此對蹄葉橐吾的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)進(jìn)行了研究，以期為蹄葉橐吾大量種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

五月中旬，于普蘭店老帽山采集生長旺盛的蹄葉橐吾嫩莖，放入磨口廣口瓶中，進(jìn)行消毒滅菌。其方法詳見參考文獻(xiàn)9。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 詳見參考文獻(xiàn)9。

1.2.2 嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將蹄葉橐吾嫩莖切成約0.2～0.3 cm的莖段，接種到含不同濃度激素的MS培養(yǎng)基，在黑暗的條件下進(jìn)行嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3 分化培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)的愈傷組織分散為獨(dú)立顆粒后，接種到以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度激素的培養(yǎng)基上，在光照的條件下進(jìn)行愈傷組織的分化培養(yǎng)。

1.2.4 試管苗生根培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)生長旺盛的不定苗，從基部剪下，接種到以MS、1/2MS、1/4MS、LS、B5、white、N6為基本培養(yǎng)基，分別附加IAA 0.1 mg/L、IBA 0.1 mg/L、NAA 0.1 mg/L、2，4-D 0.1 mg/L的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。生根試驗(yàn)重復(fù)2次，每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)100個(gè)不定芽。

1.2.5 試管苗的移栽與定植 將培養(yǎng)試管苗的培養(yǎng)瓶移到溫室中，打開瓶塞，放到較強(qiáng)的光照下煉苗3 d后，把試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，移栽到上面鋪有一層厚5～7 cm爐灰渣苗的床上。并保持溫度15℃以上、濕度90%左右、沒有直射光照的環(huán)境條件。移栽試驗(yàn)重復(fù)2次，每次移栽800株試管苗。把在溫室中，5月中旬把移栽成活的試管苗定植到大連郊區(qū)水庫邊的濕地上。定植試驗(yàn)重復(fù)2次，每次移栽700株試管苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

莖段接種培養(yǎng)后10 d左右，有的切口張裂，長出淡黃色的愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)到50 d時(shí)觀察，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1：在BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，不論與哪種生長素配合使用，均不易誘導(dǎo)形成愈傷組織。在BA濃度為0.9 mg/L時(shí)，雖然都能誘導(dǎo)形成愈傷組織，但誘導(dǎo)率較低。而在BA濃度為0.3 mg/L時(shí)，不論是含有不同濃度的NAA，還是含有不同濃度的2，4-D，愈傷組織的誘導(dǎo)率都較高。尤其是在2，4-D濃度為1.5 mg/L的培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織的誘導(dǎo)率為82%，而且外觀上長勢較好。觀察還發(fā)現(xiàn)，在BA濃度為0.3 mg/L、2，4-D濃度為1.5 mg/L的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到50 d時(shí)，所誘導(dǎo)培養(yǎng)出的愈傷組織大小為0.2 cm左右的淡黃色顆粒狀。一般認(rèn)為，這樣的愈傷組織為具有分化力的愈傷組織[10]。把這種培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)的愈傷組織接種到相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代培養(yǎng)5代，不僅培養(yǎng)的愈傷組織外觀上不變，而且生長速度加快，每個(gè)繼代周期為40 d，顆粒狀愈傷組織的增殖率達(dá)到了12.4倍。這說明MS+BA 0.3 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L的這一培養(yǎng)基是蹄葉橐吾嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

表1 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同激素配比對愈傷組織分化培養(yǎng)的影響

接種后10 d有的培養(yǎng)基上開始分化出不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)到45 d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)。結(jié)果見表2，在BA含量為0.6 mg/L，NAA含量為0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織顆粒分化率達(dá)94%，而且外觀上長勢好。在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d左右，在先已分化芽的芽基部，相繼分化出多個(gè)不定芽，培養(yǎng)到45 d時(shí)，就會分化出帶有3～7個(gè)不定芽組成的為叢生狀不定芽。把分化的不定芽從基部剪下后，接種到相同培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，經(jīng)過40 d培養(yǎng)，繼代的不定芽很快就又分化出生長較為旺盛的叢生不定芽，平均單芽的增殖系數(shù)為6.2個(gè)。經(jīng)過連續(xù)5次的繼代培養(yǎng)，其分化率基本不變，但繼代培養(yǎng)的不定芽的長勢遠(yuǎn)比直接由愈傷組織分化的不定芽旺盛，幾乎沒有無效不定芽。這說明MS+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L這一培養(yǎng)基是蹄葉橐吾愈傷組織和不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

表2 不同激素配比對愈傷組織分化的影響

2.3 不同培養(yǎng)基及不同濃度激素對生根培養(yǎng)的影響

接種培養(yǎng)到8 d時(shí)，有的培養(yǎng)不定芽基部能形成根原基，30 d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)，結(jié)果證明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L這一培養(yǎng)基的生根效果最好，不僅生根率達(dá)到了95.5%，而且試管苗長勢好。2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。由此證明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L這一培養(yǎng)基是蹄葉橐吾生根培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.4 生根試管苗的移栽與扦插

觀察表明，移栽后15 d可見成活的試管苗開始生長。30 d時(shí)平均移栽成活率為94.6%。定植后30 d平均成活率為98.6%。定植的試管苗初期生長較慢，植株較小，40 d后生長速度加快。7月上旬，與野生的蹄葉橐吾相比，試管苗具有植株整齊、葉色濃綠、根系發(fā)達(dá)等特點(diǎn)。同時(shí)，試管苗保持了野生蹄葉橐吾的所有生物學(xué)特性，8月下旬開花，9月下旬果實(shí)成熟。

3 討論

本研究對愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，40 d為一個(gè)培養(yǎng)周期，愈傷組織的增殖率為12.4倍。按此速度，一年能繁殖出12.49個(gè)后代；對不定芽進(jìn)行繼代培養(yǎng)，40 d為一個(gè)培養(yǎng)周期，不定芽的增殖系數(shù)為6.2個(gè)。按此速度，一年能繁殖出6.29個(gè)后代。僅從數(shù)量上看，后者遠(yuǎn)不及前者，但是由于后者分化的不定芽幾乎都是有效不定芽，并且長勢旺盛，這更有利于進(jìn)行生根培養(yǎng)。所以，從加快試管苗生長和更有利于快速繁殖的角度看，應(yīng)該采用不定芽分化繼代培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖。

在愈傷組織分化培養(yǎng)中，其培養(yǎng)周期為45 d；而在不定芽分化繼代培養(yǎng)中，其培養(yǎng)周期為40 d。后者的培養(yǎng)周期比前者縮短了5 d。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因有三：一是由于不定芽本身儲藏的營養(yǎng)比愈傷組織多，更有利于不定芽的分化；二是不定芽本身具有綠葉、綠色嫩莖等器官，在培養(yǎng)中能合成IAA等植物生長調(diào)節(jié)劑，有利于對自身生長分化的調(diào)節(jié)，促進(jìn)了不定芽的分化；三是兩者都是在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)的，前者是初代培養(yǎng)，需要一個(gè)適應(yīng)過程，而后者是在前者的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，對培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。

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