中心組合設(shè)計法優(yōu)化雌二醇PEG-PLA微球制備工藝研究

趙 剛 蘇 慶 李 靜 劉擁軍 朱慶增 姚丙建（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，濟(jì)南 5006）

2（山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，特種功能聚集體材料教育部重點實驗室，濟(jì)南 250100）

引言

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是世界性流行病之一，該病的發(fā)生與體內(nèi)雌二醇水平降低密切相關(guān)［1］。雌激素替代療法可迅速糾正由于體內(nèi)雌二醇匱乏導(dǎo)致的骨代謝調(diào)節(jié)失衡，增強(qiáng)再建骨轉(zhuǎn)換，建立平衡的骨代謝；同時，還可改善血降代謝，及通過雌激素受體-α作用于T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)輔助淋巴細(xì)胞因子達(dá)到平衡，有效緩解更年期綜合征等作用［2］。聚乳酸［poly（D，L-lactic acid），PLA］和聚乳酸羥基乙酸為疏水性聚合物，具有良好的生物降解和相容性［3］，其主要不足是因疏水性較強(qiáng)，導(dǎo)致對難溶性藥物不易釋放及聚合物降解后產(chǎn)生大量乳酸，影響蛋白、多肽等藥物的穩(wěn)定性［4］。聚乙二醇單甲醚-聚D，L-乳酸嵌段共聚物［poly（ethylene glycol）methoxy-poly（D，L-lactic acid）block copolymers，PEG-PLA］為新型可生物解高分子載體材料［5］，PEG-PLA為兩親性聚合物，與PLA相比該嵌段共聚物親水性增強(qiáng)，玻璃化溫度降低，降解速率加快，有利于難溶性藥物的釋放；而且可提高對蛋白及小分子多肽等藥物的穩(wěn)定性［6-7］。雌二醇不溶于水，溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。本研究以PEG-PLA為載體材料，采用儲庫式可生物降解注射用微球給藥系統(tǒng)，構(gòu)建新型適用于雌二醇的注射用微球制劑［8］。選用O/W乳化-溶劑揮發(fā)法研制注射用載雌二醇生物降解緩釋微球［9-10］。期望經(jīng)皮下或肌肉注射給藥能夠維持1個月以上的藥效，為雌激素替代療法提供安全、有效的給藥途徑。

制劑的制備工藝優(yōu)化是新制劑研究的核心內(nèi)容之一。微球制備工藝條件優(yōu)化通常采用正交設(shè)計和均勻設(shè)計，這兩種方法具有試驗次數(shù)較少，但精確度不足的特點，在模型擬合上多采用多元線性數(shù)學(xué)模型，擬合后目標(biāo)函數(shù)的復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，預(yù)測的準(zhǔn)確性尚需進(jìn)一步提高。中心組合設(shè)計（central composit design，CCD）［11-12］，安排實驗方法合理簡便，試驗次數(shù)較少，且在中心點進(jìn)行重現(xiàn)性實驗，可提高數(shù)學(xué)模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。在建立數(shù)學(xué)模型方面，采用多元二次多項式數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，使預(yù)測值更接近于實測值，實驗精確度顯著提高［13］。制備工藝條件的優(yōu)化，可根據(jù)因變量曲面法所描述的指標(biāo)值對應(yīng)自變量的變化規(guī)律，對多指標(biāo)的工藝條件進(jìn)行綜合優(yōu)化［14］。有時各指標(biāo)間會相互影響，對于某一項指標(biāo)有利的條件可能不利于另一指標(biāo)。而因變量曲面法可綜合考慮各項指標(biāo)，優(yōu)化出對各項指標(biāo)均有利的自變量區(qū)間；并在優(yōu)化的自變量區(qū)間內(nèi)選擇實驗點，對優(yōu)化的的結(jié)果進(jìn)行驗證。本項研究依據(jù)中心組合設(shè)計原理，用PEG-PLA為微球骨架材料，雌二醇為模型藥物，優(yōu)化長效注射用載雌二醇PEG-PLA生物降解緩釋微球制備工藝，制備了符合設(shè)計要求的微球，取得較佳研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

聚乙二醇單甲醚-聚D，L-乳酸嵌段共聚物（PEG2000-PLA50000，山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院合成）、雌二醇（臨湘環(huán)宇醫(yī)藥原料有限公司，批號20090301）、聚乙烯醇（PVA，acros organic公司提供，lot：A0256411）、二氯甲烷（DCM）、甲醇為分析純，水為蒸餾水。

電動數(shù)控攪拌機(jī)（天津市威華實驗儀器廠）、Waters alliance HPLC系統(tǒng)，備有996型二極管紫外監(jiān)測器，光學(xué)顯微鏡及顯微攝影系統(tǒng)（Olympus）、DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 微球的制備

按處方量精密稱取PEG-PLA和雌二醇，以二氯甲烷和甲醇混合溶劑為有機(jī)相，以一定濃度的PVA水溶液為水相，乳化溫度為1℃～5℃，攪拌速度（1 000±10）r/min，將有機(jī)相用12號針頭緩慢注入水相中，用水浴保持乳化溫度，將乳狀液傾入到400mL蒸餾水中，繼續(xù)攪拌，直至溶劑揮發(fā)完全。過濾，收集微球，蒸餾水200mL洗滌后，真空干燥48h。

1.2.2 微球含量及包封率的測定

精密稱取微球適量（含雌二醇約2.5mg）于10mL刻度試管，加入CH2CL2-MeOH（9∶1，V/V）2.5mL，漩渦震蕩1min，至微球完全溶解，用甲醇-水（75∶25，v/v）溶液定容至10mL，搖勻。取上述溶液1mL置10mL容量瓶中，加入流動相：甲醇-水（75∶25，v/v）溶液稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，精密吸取10μL進(jìn)樣。HPLC條件：流動相為甲醇-水（75∶25，v/v），色譜柱C18（4.6mm×250mm，5μm），檢測波長280nm，流速1mL/min，外標(biāo)法定量。

包封率=（微球重量×微球藥物含量/投藥量）×100％

1.2.3 形態(tài)觀察、粒徑大小和分布

光學(xué)顯微鏡下觀察微球的形態(tài)并拍照。采用顯微計數(shù)法測定微球的粒徑，根據(jù)測定的粒徑數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理求得平均。粒徑分散度用跨距（span of dispersity）表示，計算公式為跨距=（D90-D10）/D50，其中D10、D50、D90分別只有10％，50％，90％的微球其粒徑均小于該值所示的粒徑。

1.2.4 實驗設(shè)計

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選擇對微球制備影響較顯著的3個因素作為考察對象。即水相乳化劑PVA濃度（％，W/W）（X1）、有機(jī)相PEG-PLA濃度（mg/mL）（X2）和理論載藥量（X3）=投藥量/（投藥量+PEG-PLA投料量）（％，W/W）。根據(jù)CCD原理，每個因素設(shè)5個水平。各因素取值區(qū)間端點水平可根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果和制備所需微球的具體情況而定。表1為因素和水平及其對應(yīng)的物理量。

表1 因素和水平及其對應(yīng)的物理量表Tab.1 Independent variable and their correspondent values in coded and physical form

模型擬合和預(yù)測：以產(chǎn)率、包封率、平均粒徑和跨距為因變量；外水相中PVA濃度（X1）有機(jī)相PEG-PLA濃度（X2）和理論載藥量（X3）為自變量，分別將各因素（自變量）各水平對指標(biāo)（因變量）進(jìn)行多元線性回歸和二次多項式回歸擬合。數(shù)學(xué)模型為

二次多項式回歸：

經(jīng)逐步回歸計算，求得復(fù)相關(guān)系數(shù)較高的目標(biāo)函數(shù)，根據(jù)該目標(biāo)函數(shù)，繪制三維因變量曲面（response surface）圖，由因變量曲面圖選取較佳的工藝條件，按優(yōu)化的工藝條件制備微球，并進(jìn)行預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型擬合

各處方的產(chǎn)率、包封率、平均粒徑和跨距見表2（5-8列），經(jīng)多元線性逐步回歸計算目標(biāo)函數(shù)，其方程式如下：

產(chǎn)率

Y=74.843 2-3.687 7X1+0.088 5X2-0.235 3X3

（r=0.6474；P＜0.05）

包封率

Y=98.203 1-3.426 6X1-0.032 9X2-0.2310X3

（r=0.450 7；P＜0.50）

平均粒徑

Y=18.557 8+1.528 8X1+0.075 9X2+0.355 7X3

（r=0.632 4；P＜0.1）

跨距

Y=1.027 9-0.027 6X1-0.000 2X2+0.004 1X3

（r=0.097 3；P＜1.0）

多元線性逐步回歸擬合結(jié)果表明：復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，故不使用線性模型進(jìn)行優(yōu)化分析。

采用二次多項式回歸模型進(jìn)行擬合，經(jīng)逐步回歸計算目標(biāo)函數(shù)，其擬合方程式為

產(chǎn)率

Y=40.524 4+15.615 2X1+0.395 3X2+1.459 5X3+0.131 1X32-0.068 8X1X2-1.380 3X1X3-0.026 1X2X3

（r=0.912 62；P＜0.005）

產(chǎn)率與嵌段共聚物濃度（X2）顯著相關(guān)（P＜0.005），與PVA濃度（X1）有相關(guān)性（P＜0.10）

包封率

Y=32.573 7+10.464 7X1+0.416 9X2+7.937 6X3+1.964 9X12-0.146 7X32-0.067 4X1X2-1.253 1X1X3-0.042 1X2X3

（r=0.964 15；P＜0.001）

包封率與嵌段共聚物濃度（X2）、理論載藥量（X3）呈顯著相關(guān)性（P＜0.001），與PVA濃度（X1）和理論載藥量（X3）之間的交互作用（X1X3）呈顯著相關(guān)性（P＜0.005）。由于這種交互作用的存在，二次多項式比線性回歸擬合表現(xiàn)出較好的相關(guān)性，復(fù)相關(guān)系數(shù)顯著提高。

平均粒徑

Y=9.713 1+32.108 5X1+0.134 3X2-1.591 2X3-5.267 1X12-0.000 5X22+0.021 0X32-0.143 2X1X2-0.577 7X1X3+0.021 8X2X3

（r=0.963 22；P＜0.005）

平均粒徑與PVA濃度（X1）呈顯著相關(guān)性（P＜0.001），與PVA濃度（X1）和嵌段共聚物濃度（X2）之間的交互作用（X1X2）呈顯著相關(guān)性（P＜0.005）。

跨距

Y=0.436 0+1.811 1X1-0.012 4X2+0.051 4X3+0.000 1X22-0.003 5X32-0.012 2X1X2-0.068 9X1X3+0.000 9X2X3

（r=0.962 79；P＜0.005）

跨距與PVA濃度（X1）呈顯著相關(guān)性（P＜0.001），與PVA濃度（X1）和嵌段共聚物濃度（X2）之間的交互作用（X1X2）呈顯著相關(guān)性（P＜0.001），與PVA濃度（X1）和理論載藥量（X3）之間的交互作用呈顯著相關(guān)性（P＜0.005）。

表2 微球制備影響參數(shù)及其對應(yīng)的因變量測定值Tab.2 Influencing parameters for microsphere preparation（X1～X3）and corresponding measures of microspheres

2.2 優(yōu)化與預(yù)測

2.2.1 產(chǎn)率

圖1為依據(jù)二次多項式回歸模型擬合的產(chǎn)率的目標(biāo)函數(shù)計算得到的效應(yīng)曲面圖。該圖表明：X2增加產(chǎn)率顯著提高。

2.2.2 包封率

圖2為依據(jù)二次多項式回歸模型擬合的包封率的目標(biāo)函數(shù)計算得到的效應(yīng)曲面圖。該圖表明：X2和X3的增加有利于提高包封率。

2.2.3 平均粒徑

圖3為依據(jù)二次多項式回歸模型擬合的平均粒徑的目標(biāo)函數(shù)計算得到的效應(yīng)曲面圖。該圖表明：平均粒徑隨X2增加而顯著增大。在X2較小（50mg/mL）時，X1增加平均粒徑增大；在X2較大（150mg/mL）時，X1增加對平均粒徑影響很小。

2.2.4 跨距

圖4為依據(jù)二次多項式回歸模型擬合的跨距的目標(biāo)函數(shù)計算得到的效應(yīng)曲面圖。該圖表明：隨X1的增加跨距呈逐漸增大趨勢。

2.2.5 微球制備的優(yōu)化條件

表3為根據(jù)三維效應(yīng)曲面得到的微球制備的優(yōu)化實驗條件。在此優(yōu)化條件下制備的微球的性能指標(biāo)如表4所示，預(yù)測值和實測值的偏差在可接受的范圍之內(nèi)。優(yōu)化前后制備的微球外觀對比如圖5所示，從外觀看有明顯改善。

圖1 產(chǎn)率的效應(yīng)曲面圖：產(chǎn)率為有機(jī)相PEG-PLA濃度（mg/mL）（X2）和水相乳化劑PVA濃度（％，W/W）（X1）的函數(shù)，理論載藥量（X3）取中值9％（W/W）Fig.1 Predicted response surface of yield as a function of PEG-PLA concentration in organicphase（X2）and polyvinyl alcohol concentration in aqueous phase（X1），with theoretical drug content（X3）equal to 9.00％.

圖2 包封率的效應(yīng)曲面圖：包封率為有機(jī)相PEG-PLA濃度（mg/mL）（X2）和理論載藥量（％，W/W）（X3）的函數(shù)，水相乳化劑PVA濃度（X1）取中值1.05％（W/W）Fig.2 Predicted response surface of loading efficiency as a function of PEG-PLA concentration in organic phase（X2）and theoretical drug content（X3），with polyvinyl alcohol（X1）equal to 1.05％.

表3 根據(jù)三維效應(yīng)曲面圖優(yōu)化的自變量區(qū)間Tab.3 Optimal range of independent variables obtained from three-dimensional response surface plots

圖3 平均粒徑的效應(yīng)曲面圖：平均粒徑為水相乳化劑PVA濃度（％，W/W）（X1）和有機(jī)相PEG-PLA濃度（mg/mL）（X2）的函數(shù)，理論載藥量（X3）取中值9％（W/W）Fig.3 Predicted response surface of mean diameter as a function of polyvinyl alcohol concentration in aqueous phase（X1）and PEG-PLA concentration in organic phase（X2），with theoretical drug content（X3）equal to 9.00％

圖4 跨距效應(yīng)曲面圖：跨距為水相乳化劑PVA濃度（％，W/W）（X1）和有機(jī)相PEG-PLA濃度（mg/mL）（X2）的函數(shù)，理論載藥量（X3）取中值9％（W/W）Fig.4 Predicted response surface of span of dispersity as a function of polyvinyl alcohol concentration in apueous and PEG-PLA concentration in organic phase（X2），with theoretical drug content（X3）equal to 9.00％

3 討論

3.1 PVA濃度對產(chǎn)率和跨距的影響

由三維因變量效應(yīng)曲面圖（見圖1）可以看出，隨PVA濃度的增加微球產(chǎn)率逐漸增加。連續(xù)相中PVA濃度增加使油/水界面張力顯著降低，Laplace壓力梯度ΔP=2γ/R（R為液滴半徑，P為壓力）降低，體系界面過剩自由能γΔA（γ為界面張力，A為界面面積）降低。使形成乳狀液的耗能降低。因此在其他條件一定時，增加PVA濃度，使ΔA增加，導(dǎo)致微球產(chǎn)率增加。但PVA濃度對微球中雌二醇的包封率有一定影響，在制備的微球圓整，碎片較少的前提下，應(yīng)選擇低濃度PVA，有利于提高包封率。PVA濃度與PEG-PLA濃度之間的交互作用對跨距的影響較顯著。PEG-PLA在較高濃度（100～150mg/mL）條件下，PVA濃度降低，跨距有所減小。

圖5 顯微鏡觀察載雌二醇PEG-PLA微球（放大倍數(shù)：10×10倍）。（a）處方3樣品；（b）優(yōu)化后處方樣品Fig.5 Optical micrograph of estradiol-loaded PEG-PLA microspheres（10×10）.（a）the sample of formulation 3；（b）the sample of optimal formulation

表4 根據(jù)優(yōu)化的實驗條件制備載雌二醇PEG-PLA微球，其包封率、平均粒徑及跨距的預(yù)測值和實驗測定值Tab.4 Predicted and experimental values of loading efficiency，mean diameter and Span of dispersity of estradiol-loaded PEG-PLA microspheres prepared according to the optimal experimental Conditions（X1=1.10％ X2=100mg/mL X3=5.00％）

3.2 PEG-PLA濃度對包封率的影響

根據(jù)三維因變量效應(yīng)曲面圖（圖2），PEG-PLA濃度變化對包封率影響顯著。PEG-PLA濃度升高，有機(jī)相粘度增大，在乳狀液中的乳滴固化形成微球的過程中，分散相中的溶劑被萃取，在空氣/水界面揮發(fā)，隨著溶劑的移除，乳滴逐漸固化形成微球，分散相中較高濃度的PEG-PLA可使乳滴表面的囊壁層快速形成并使乳滴固化時間縮短，減少藥物從分散相向連續(xù)相的遷移，有助于提高包封率。且較高濃度的PEG-PLA也有利于微球的形成。

3.3 理論載藥量對包封率的作用

由于雌二醇在水中不溶，采用O/W乳化溶劑揮發(fā)法制備微球可達(dá)到較高的包封率。理論載藥量愈高，向水相擴(kuò)散泄漏藥物的百分比愈小，微球的包封率也相應(yīng)增大。但理論載藥過高時，藥物在有機(jī)相中溶解度趨于飽和，在溶劑揮發(fā)移除過程中藥物在O/W界面富集，隨著溶劑萃取揮發(fā)過程的進(jìn)行，在微球表面會析出藥物結(jié)晶。

此外，在溶劑揮發(fā)乳滴逐漸固化形成微球的過程中，溫度是影響微球成形的重要因素之一，此過程適合在較低溫度、機(jī)械攪拌較平穩(wěn)條件下進(jìn)行，可減少碎片生成，有利于微球形態(tài)圓整及提高包封率。

4 結(jié)論

中心組合設(shè)計法優(yōu)化處方和制備工藝，方法簡便，可對多因素和多指標(biāo)的實驗進(jìn)行綜合優(yōu)化篩選，對試驗結(jié)果預(yù)測較準(zhǔn)確，是進(jìn)行多因素及多指標(biāo)處方和制備工藝優(yōu)化篩選的較佳方法。制備載雌二醇PEG-PLA微球符合要求，具有臨床應(yīng)用前景。

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