黑龍江省黑河市周邊地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

文 / 朱少奇 喬 潔 黑龍江省黑河市畜牧獸醫(yī)局

奶牛乳房炎是乳腺受到物理、化學(xué)、微生物等因素的刺激所發(fā)生的一種炎癥變化，是一種多因素疾病綜合征。

奶牛乳房炎是目前危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一，每年可造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。雖然有多種病原微生物可引起奶牛乳房炎，但國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的最常見(jiàn)、最主要的病原為金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌等腸桿菌[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，牛場(chǎng)獸醫(yī)對(duì)奶牛乳房炎的治療以抗生素治療為主，但常規(guī)抗生素治療的結(jié)果并不理想。為進(jìn)一步了解奶牛乳房炎病原菌的發(fā)展變化趨勢(shì)以及設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的治療方案，本文對(duì)黑龍江省黑河市璦琿區(qū)4 個(gè)規(guī)?；?chǎng)的奶樣進(jìn)行了微生物學(xué)調(diào)查和藥敏試驗(yàn)，以期為乳房炎的防治提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣

以黑龍江省黑河市璦琿區(qū)四嘉子鄉(xiāng)、河南屯鄉(xiāng)以及幸福鄉(xiāng)的4 個(gè)奶牛養(yǎng)殖小區(qū)作為試驗(yàn)基地，選取隱性乳房炎（BMT陽(yáng)性）或臨床型乳房炎患牛發(fā)病乳區(qū)100 個(gè)，于采取治療措施之前，對(duì)發(fā)病乳區(qū)乳頭嚴(yán)格消毒，采集奶樣（2 mL/乳區(qū)）至無(wú)菌管內(nèi)。

1.1.2 培養(yǎng)基

犢牛血清、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、高鹽甘露醇瓊脂、7%羊血瓊脂、麥康凱瓊脂、MH 瓊脂、氧化酶、馬尿酸鈉、山梨醇、七葉苷、生化管（成套）、微量發(fā)酵管，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923 （β溶血）、大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏紙片

青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素、鏈霉素，均購(gòu)自哈爾濱生物制藥一廠。

1.1.5 診斷試劑

隱性乳房炎診斷液（簡(jiǎn)稱LMT），購(gòu)自蘭州中獸醫(yī)研究所。

生1：我把幾何圖形分為兩類，一類是立體的，比如：長(zhǎng)方體、正方體、圓柱、圓錐、球、棱柱、棱錐等；一類是平面的，比如：正方形、長(zhǎng)方形、圓、三角形等．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶樣采集

選取隱性乳房炎陽(yáng)性（經(jīng)BMT對(duì)所選奶牛進(jìn)行隱性乳房炎檢測(cè)）乳區(qū)或臨床型乳房炎乳區(qū)100 個(gè)。用75%酒精溶液消毒乳頭孔處后，傾斜帶無(wú)菌棉拭子的試管，將管口對(duì)準(zhǔn)乳頭孔，采集乳汁3～5 mL。采樣過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作。

1.2.2 微生物分離培養(yǎng)

分別將無(wú)菌采集的隱性乳房炎或臨床型乳房炎乳樣搖勻，吸1 mL加入到10 mL含5%犢牛血清的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，同時(shí)用接種環(huán)無(wú)菌取樣涂布于羊血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。將平板上的單個(gè)典型菌落（如未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)則用肉湯培養(yǎng)物接種到羊血瓊脂平板，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h）分別接種到鑒別培養(yǎng)基中，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h 。觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特征，經(jīng)革蘭氏染色后進(jìn)行鏡檢，并通過(guò)觸酶、氧化酶試驗(yàn)進(jìn)行純檢，初步判定細(xì)菌種類。

1.2.3 細(xì)菌生化鑒定

根據(jù)初步鑒定結(jié)果，對(duì)分離到的菌株有選擇地進(jìn)行生化試驗(yàn)。中等大小G-桿菌，接種于三糖鐵培養(yǎng)基，再用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ—15e 進(jìn)行生化鑒定；G+葡萄球菌按葡萄球菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管TH—16s進(jìn)行生化鑒定；G+鏈球菌進(jìn)行CAMP試驗(yàn)及鏈球菌生化鑒定，包括馬尿酸鈉水解試驗(yàn)，甘露醇、山梨醇和七葉苷發(fā)酵試驗(yàn)等。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，將經(jīng)過(guò)鑒定的菌株各隨機(jī)選擇4 株，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯純培養(yǎng)液，37 ℃ 培養(yǎng)18～24 h ，滴加1 mL培養(yǎng)液于血瓊脂平板表面，用“L”形涂布棒均勻涂布。待平板表面稍干燥后，用無(wú)菌鑷子夾取抗菌藥物紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h 后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各藥的抑菌環(huán)直徑。計(jì)算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑。直徑小于16 mm為不敏感，16～20 mm為中度敏感，大于20 mm為高度敏感。供試驗(yàn)藥物為青霉素G、頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素和鏈霉素。

表1 100 個(gè)奶牛乳房炎陽(yáng)性奶樣細(xì)菌鑒定結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)觀察

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血平板、高鹽甘露醇瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，菌落形態(tài)為圓形、濕潤(rùn)、突起、光滑、邊緣規(guī)則的淡黃色小菌落；在血平板上見(jiàn)明顯溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)；在肉湯中渾濁、沉淀，并在管壁形成菌環(huán)；革蘭氏染色為G+，呈葡萄串狀、成雙或單個(gè)排列的球菌，可初步判斷為金黃色葡萄球菌。

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng)不良，在羊血平板上生長(zhǎng)良好，可見(jiàn)圓形、灰白色、突起、光滑、較濕潤(rùn)小菌落，多呈β型溶血；觸酶試驗(yàn)陰性，CAMP 試驗(yàn)陽(yáng)性；革蘭氏染色為鏈狀、短鏈狀或成雙排列的G+圓型或卵圓型球菌，可初步判斷為鏈球菌。

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，形成圓形、乳白色、突起、光滑、較濕潤(rùn)中等大小菌落，麥康凱瓊脂平板上呈紅色；革蘭氏染色為G-桿菌，可初步判斷為大腸桿菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

根據(jù)觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，參考《葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)（TH-16s）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規(guī)定的生化培養(yǎng)鑒定指標(biāo)進(jìn)行鑒定。觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，發(fā)酵甘露醇，硝酸鹽、V-P陽(yáng)性，溶血明顯，可判斷為葡萄球菌。

發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，不發(fā)酵山梨醇、棉籽塘；水解馬尿酸鈉、水楊苷、膽汁，不水解明膠、七葉苷；CAMP、吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)、甲基紅、觸酶試驗(yàn)陰性，可判斷為無(wú)乳鏈球菌。

根據(jù)CAMP 試驗(yàn)結(jié)果，以及水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽的能力區(qū)分無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌。無(wú)乳鏈球菌不水解七葉苷（非發(fā)酵），水解馬尿酸鹽，CAMP 試驗(yàn)陽(yáng)性；停乳鏈球菌不水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽CAMP試驗(yàn)陰性，非β型溶血；乳房鏈球菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物呈均勻渾濁，能水解七葉苷（非發(fā)酵）和馬尿酸鹽，CAMP 試驗(yàn)陰性。

當(dāng)鏡檢為G-桿菌，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶陰性時(shí)，接種麥康凱瓊脂平皿、三糖鐵瓊脂斜面陽(yáng)性后，根據(jù)《腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定冊(cè)（GYZ-15e）》（杭州市天和微生物試劑有限公司）中規(guī)定的生化培養(yǎng)鑒定指標(biāo)進(jìn)行鑒定，即在麥康凱瓊脂平皿菌落為粉紅色、V-P陰性、不分解尿素、構(gòu)椽酸鹽陰性、MR 和吲哚陽(yáng)性，三糖鐵產(chǎn)酸產(chǎn)氣即可判斷為大腸桿菌。

2.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

對(duì)100 個(gè)陽(yáng)性乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出，在75 份血清中檢出10 種共89 個(gè)菌株，檢出率為75%（75/100），其中葡萄球菌33 株，占37.1%；鏈球菌33 株，占37.1%；大腸桿菌9 株，占10.1%。從表1中可以看出，葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌是采樣牧場(chǎng)引起乳房炎的主要致病菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離出的主要病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明：病原菌基本上對(duì)青霉素G、鏈霉素產(chǎn)生耐藥性；金葡菌對(duì)阿奇霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、先鋒V、氯霉素高度敏感；表皮葡萄球菌對(duì)頭孢噻肟、卡那霉素、阿米卡星高度敏感；無(wú)乳鏈球菌對(duì)氯霉素、四環(huán)素、阿米卡星高度敏感；停乳鏈霉菌對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、先鋒VI、頭孢噻肟高度敏感。乳房鏈霉菌和大腸桿菌只對(duì)環(huán)丙沙星和先鋒V敏感。病原菌對(duì)本試驗(yàn)其余藥物中度敏感。

3 討論

從奶牛乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果可以看出，采樣牧場(chǎng)引起奶牛乳房炎的主要病原菌是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌。這與黑河周邊地區(qū)奶牛養(yǎng)殖現(xiàn)狀密切相關(guān)。飼料營(yíng)養(yǎng)失衡、管理不善、欄舍潮濕、養(yǎng)殖小區(qū)衛(wèi)生條件差、擠奶設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)不及時(shí)或消毒不徹底都會(huì)引起乳房炎發(fā)生。因而，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)切實(shí)加強(qiáng)牛群飼養(yǎng)管理與擠奶設(shè)備的維護(hù)。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同來(lái)源的分離菌株對(duì)頭孢噻肟、先鋒V、先鋒VI、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素高敏；但對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氨芐青霉素已出現(xiàn)耐藥趨勢(shì)；青霉素G、鏈霉素對(duì)所有菌株已幾乎無(wú)效。以上結(jié)果，一方面表明了當(dāng)前本地奶牛乳房炎的治療首選藥物主要有以上6 種；另一方面，由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株的數(shù)量愈來(lái)愈多[3]。在防治奶牛乳房炎時(shí)，臨床用藥要注意按規(guī)定的劑量與療程使用，及時(shí)更換不同的敏感藥物進(jìn)行治療，以免產(chǎn)生過(guò)多的耐藥現(xiàn)象，不利于今后的治療，而且還會(huì)影響人類用藥及身體健康?！?/p>

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

[1]卜仕金. 奶牛乳房炎的抗菌藥物防治. 獸藥與飼料添加劑，1999，4（3）：14-16.

[2]袁永隆，張禮華，劉春傳，等. 我國(guó)奶牛乳房炎常見(jiàn)病原菌的區(qū)系調(diào)查. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1992，25（4）：70-76.

[3]孔雪旺，陳功義. 奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn). 中國(guó)奶牛，2007（1）：43-44.