草菇培養(yǎng)料中微生物總DNA的高效提取1)

侯立娟 李玉 孟麗(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)John A.Buswell陳明杰(上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所)宋金俤(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所)

草菇(Volvariella volvacea(Bull.:Fr)Sing.)具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值、商業(yè)價值和生產(chǎn)價值，現(xiàn)已發(fā)展成為世界性栽培的食用菌之一，其產(chǎn)量位居世界食用菌產(chǎn)量的第10位。1970年以前，草菇的栽培主要以稻草生料為主，自1971年，張樹庭教授采用經(jīng)二次發(fā)酵的廢棉栽培草菇，提高了其產(chǎn)量［1］。培養(yǎng)料在自然發(fā)酵過程中微生物區(qū)系發(fā)生了改變，但是，有關(guān)微生物的動態(tài)變化尚未見報道。DNA的PCR擴增是研究分子生物學的基本方法，提取的DNA純度和產(chǎn)量對后續(xù)試驗的開展至關(guān)重要，對于同一批次的培養(yǎng)料采用不同DNA提取方法或是不同批次培養(yǎng)料采用同一種提取方法其產(chǎn)量和質(zhì)量都存在較大差異。由于草菇培養(yǎng)料中，腐殖酸含量較高，是土壤樣品的10～100倍［2］，而且還含有大量的有機質(zhì)、多糖、棉酚、微生物的代謝產(chǎn)物以及一些雜質(zhì)，其環(huán)境樣品的組成較為復雜，因此，DNA的提取方法具有重要意義。本研究通過6種DNA提取方法的比較，旨在篩選出一種或幾種有效提取栽培前、栽培后培養(yǎng)料總DNA的方法，為研究其微生物的組成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

栽培草菇的培養(yǎng)料，其主要成分為廢棉(95%)、石灰(5%)，含水量(65±2.8)%，pH值(9.0±0.5)。采集地為上海浦東新區(qū)的上海食用菌所高橋基地。采用5點法取樣，混勻，用滅菌的聚丙烯袋收集樣品，-30℃保存。

1.2 提取草菇培養(yǎng)料中總DNA方法

采用6種方法對草菇培養(yǎng)料總DNA進行提取，除試劑盒提取所用樣品為0.020 0 g外，其余方法均為0.200 0 g，用液氮研磨，-30℃保存?zhèn)溆?。具體提取方法為:①化學裂解與酶裂解相結(jié)合法。用4 mL的磷酸緩沖液洗滌樣品3次［3］，去除胞外DNA和可溶性的有機物質(zhì)。參見文獻［4］進行DNA的提取。為減少機械損傷，采用酶解法(細胞裂解液中含2.5 g/L溶菌酶，25 g/L溶壁酶)取代beadmill法。酶解結(jié)束后，加入150μL 20%的SDS，0.15 g PVPP，65℃水浴1.5 h。采用PEG28000(最終質(zhì)量分數(shù)為10%的PEG，1.1 mol/L的NaCl)進行DNA的沉淀，4℃靜置2 h以上，16 000 r/min離心15 min，即可獲得核酸沉淀。②氯化芐法。參照朱衡等［5］的方法。在樣品中加1 mL提取液(100 mmol/L Tris HCl，pH值9.0;0.040 mmol/L EDTA，pH值8.0)，充分混勻，加0.1 mL 10%SDS，0.3 mL氯化芐，劇烈振蕩成乳狀，在50℃條件下溫浴1 h，間隔10 min混勻一次，加0.3 mL 3 mol/L NaAC(pH值5.2)混勻，然后冰浴15 min，4℃，6000 r/min離心15 min，取上清液，加等體積異丙醇室溫沉淀20 min，室溫，1 000 r/min離心15 min，沉淀用70%乙醇洗2次，吸干后溶于TE，測OD值，保存于-20℃。③CTAB法。采用植物基因組DNA提取的CTAB法［6］。將樣品加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫45 min以上，間或輕搖混勻;室溫，12000r/min離心20min。取上清液，加入與之等體積的氯仿—異戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，輕輕混勻15 min以上，室溫，12000 r/min離心20 min，取上清液移入新離心管中;加入2/3體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動5 min，室溫，8 000 r/min離心10 min，去上清;沉淀用75%乙醇10 mmol/L KAC抽提2～3次，每次8 000 r/min室溫離心10 min;加入預(yù)冷的95%乙醇，輕輕上下顛倒，室溫，12 000 r/min離心20 min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干;加入200μL TE buffer，輕輕敲打使沉淀溶解;加入1μL 10 g/L RNAase，37℃水浴，保溫1 h，去除RNA;DNA提取物于冰箱中-20℃貯藏備用。④改良CTAB法。在CTAB法的基礎(chǔ)上，稍作改良［7］，該方法在上海市農(nóng)業(yè)科學院實驗室廣泛應(yīng)用于各種真菌菌絲的提取。將樣品加入65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液，65℃保溫60 min，間或輕搖混勻;12 000 r/min室溫離心10 min;取上清液，加入與之等體積的酚—氯仿混合溶液(V(酚)∶V(氯仿)=1∶1)，混勻1 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，上清液中加入與之等體積的氯仿—異戊醇混合溶液(V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1)，輕輕混勻1 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液移入新離心管中;加入0.1倍體積的-20℃預(yù)冷3 mol/L NaAC，等體積的異丙醇，-30℃放 置30 min，4℃ 12 000 r/min離 心10 min，在沉淀中加入沉淀用70%乙醇1 mL洗滌2～3次，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄乙醇，真空抽干或自然晾干;加入100μL TE buffer，輕輕敲打使沉淀溶解;加入1μL 10 g/L RNAase，4℃水浴1 h，去除RNA;DNA提取物于冰箱中-20℃貯藏備用。⑤MP土壤試劑盒提取法(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)。提取方法參見試劑盒說明書。⑥新型植物基因組DNA試劑盒提取法(天根生物技術(shù)，北京，中國)。參見試劑盒說明書提取。

1.3 DNA的質(zhì)量檢測

6種提取方法的總DNA經(jīng)0.1%瓊脂糖凝膠電泳，用5 μL的總DNA和1μL的6×loading buffer點樣，用λDNA做為Marker。EB染色并用EC3 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。DNA濃度儀測定DNA的A260/A280、A260/A230。

1.4 純化粗DNA

將6種方法提取得到的DNA溶液按照上海申能博彩3SDNAPurification Kit說明書過柱純化。

1.5 聚合酶鏈式反應(yīng)擴增微生物DNA

將各個方法純化后的DNA作為模板，稀釋到50 mg/L。為檢測提取的總DNA樣品對PCR擴增的影響，分別用真菌、細菌、放線菌特異性引物進行PCR擴增。反應(yīng)體系25μL，包括10×Taq Reaction Buffer 2.5μL，Mg2+(25 mol/mL)2μL，dNTP(10 mol/mL)0.5μL，5'引物(25 mol/L)0.5μL，3'引物(25 mol/mL)0.5μL，模板DNA(50 mg/L)0.5μL，DNA Taq聚合酶(5 U/μL，BBI，China)0.5μL，蒸餾水18μL。引物序列及反應(yīng)條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇培養(yǎng)料中總DNA提取方法的差異

用6種方法提取草菇培養(yǎng)料中總DNA，電泳結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，電泳條帶清晰，整潔，DNA的分子量大約在40 kB左右，不會對后續(xù)操作產(chǎn)生影響，各方法提取DNA條帶的亮度存在差異，其中用植物試劑盒提取的DNA條帶亮度不及其他處理，這可能是由于樣品量的原因。植物試劑盒提取按照說明書的用量為0.020 0 g。

圖1 不同方法提取的草菇培養(yǎng)料中總DNA瓊脂糖漿電泳圖

2.2 不同提取方法DNA產(chǎn)量和質(zhì)量

各個方法提取的DNA產(chǎn)量存在一定的差異(表2)。由表2可見，化學裂解與酶裂解相結(jié)合法提取的DNA產(chǎn)量最高，植物試劑盒提取法的產(chǎn)量最低，分別為(2 372.72±28.85)μg/g和(87.67±2.04)μg/g。化學裂解與酶裂解相結(jié)合法比氯化芐法、CTAB法、改良CTAB法、MP土壤試劑盒提取法、植物試劑盒提取法分別提高2.3、6.1、13.5、13.4、25.9倍。除氯化芐法提取的DNA顏色為深棕色，純化后為黃棕色外，其余5種方法提取的DNA的顏色均呈白色，經(jīng)過純化后無色透明。各個方法的A260/A280及A260/A230的比值也存在差異，但是除了氯化芐法外，其余方法A260/A280的比值均達到或接近1.8，A260/A230比值達到或超過2(數(shù)據(jù)未列出)，說明純化效果比較明顯。從各方法的變異系數(shù)來看，化學裂解與酶裂解相結(jié)合法和MP土壤試劑盒提取法的變異系數(shù)較小。

2.3 各方法提取總DNA稀釋到50 mg/L擴增微生物結(jié)果

分別用4種真菌、3種細菌和1種放線菌的特異性引物進行微生物擴增。擴增結(jié)果見圖2。由圖2可見，各方法提取的DNA用于擴增微生物，其結(jié)果主要區(qū)別在于目的條帶的有無，目的條帶的多少，以及目的條帶亮度的強弱。對于真菌的18 S區(qū)域，與其他方法相比，MP土壤試劑盒和植物試劑盒有微弱的目的條帶，其他方法均未擴增出目的條帶;對于真菌的28 S區(qū)域，除了氯化芐法外，其余的方法均能擴增出370 bp目的條帶;對于真菌的ITS3-4區(qū)域和ITS1-4區(qū)域，除了氯化芐方法外，其余方法均能擴增出公共目的條帶，并且化學裂解與酶裂解相結(jié)合法和MP土壤試劑盒提取的DNA擴增出的目的條帶多。擴增3種細菌和1種放線菌的結(jié)果與擴增真菌的結(jié)果相同，除了氯化芐法外，其余方法均能擴增出公共目的條帶，而且化學裂解與酶裂解相結(jié)合法、MP土壤試劑盒和植物試劑盒提取的DNA比其余方法擴增出的目的條帶多。因此，除了氯化芐方法外，其余方法均能同時有效地提取細菌、真菌和放線菌總DNA，說明其質(zhì)量滿足PCR擴增要求。

表1 真菌、細菌、放線菌引物序列及反應(yīng)條件

表2 各方法提取草菇培養(yǎng)料DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量

圖2 各方法提取的草菇培養(yǎng)料DNA稀釋到50 mg/L PCR擴增微生物的電泳結(jié)果

2.4 不同方法提取時間、費用成本的差異

由表3可見，MP土壤試劑盒提取法和植物試劑盒提取法提取時間相對較短，不到1 h，化學裂解與酶裂解相結(jié)合法所用的提取時間最長，為7 h。從花費的成本來看，MP土壤試劑盒提取法需要73.28元，其次是化學裂解與酶裂解相結(jié)合法，氯化芐法的成本最少，為0.05元。

表3 不同提取方法提取草菇培養(yǎng)料中總DNA所需時間及費用成本

3 結(jié)束語

基于DNA分析的分子技術(shù)，解決與培養(yǎng)方法有關(guān)的問題，說明環(huán)境樣品微生物種群的多樣性及微生物種群結(jié)構(gòu)［15-16］，據(jù)報道檢測雙孢菇在堆肥過程中微生物群落的分子技術(shù)存在差異［17］，因此，DNA提取是研究分子生物學的基本技術(shù)，本研究采用包括2種試劑盒提取在內(nèi)的6種定量提取方法，從產(chǎn)量、質(zhì)量、擴增微生物、所用時間及成本5個方面綜合比較了6種提取培養(yǎng)料DNA的方法，結(jié)果表明:①最有效地提取培養(yǎng)料中DNA的是化學裂解和酶裂解相結(jié)合法。此方法包括加入PVPP的高鹽裂解液結(jié)合PEG—8000沉淀DNA，SDS裂解、生物酶(溶菌酶、溶壁酶及蛋白酶K)進行細胞破壁，減少腐殖酸的污染［18-19］，能夠減少如玻璃珠的機械損傷，減少PCR擴增的斷裂小片段［20-21］。②氯化芐法提取的DNA產(chǎn)量不低，但純度不夠，純化后不能擴增出目的條帶。提取的DNA深棕色，推測為CTAB、SDS、酚類、異丙醇等物質(zhì)嚴重干擾擴增結(jié)果［22］，此方法不適于草菇培養(yǎng)料DNA的提取。③除氯化芐方法外，其余5種方法經(jīng)過3S柱純化后的A260/A280值達或接近到1.8和2.0，都適合PCR擴增，表明純化效果顯著。提取培養(yǎng)料總DNA是借鑒從土壤或沉淀中提取DNA的方法［18，23-24］。④從提取DNA的時間進行評價，化學裂解和酶裂解相結(jié)合法所用的時間最長，試劑盒提取的時間短。⑤從成本上比較，以進口的試劑盒費用昂貴，MP土壤試劑盒提一個樣品需要73.28元，其次是化學裂解和酶裂解相結(jié)合法，氯化芐法所用的試劑相對便宜但擴增效果不佳。

［1］王玉華，傅曉芳，陳成枝.新編蘑菇草菇優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1987.

［2］Pfaller S L，Vesper S J，Moreno H.The use of PCR to detect a pathogen in compost［J］.Compost Sci Util，1994，2:48-54.

［3］LaMontagne M G，Michel F CJr，Holden PA，et al.Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis［J］.JMicrobiol Methods，2002，49(3):255-264.

［4］Howeler M，Ghiorse W C，Walker L P.A quantitative analysis of DNA extraction and purification from compost［J］.J Micro Methods，2003，54:37-45.

［5］朱衡，瞿峰，朱立煌.利用氯化芐提取適于分子生物學分析的真菌DNA［J］.真菌學報，1994，13(1):34-40.

［6］欒雨時，包永明.生物工程實驗技術(shù)手冊［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2005:156-159.

［7］張紅，秦蓮花，譚琦，等.用改進的CTAB法提取香菇基因組DNA［J］.上海大學學報:自然科學版，2006，12(5):547-550.

［8］White T J，Bruns T D，Lee S B，et al.Amiplifucation and direct sequencing of fungi ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//lnnis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，et al.PCR Protocol:a guide to methods and applications.New York:USA Academic Press，1990:315-322.

［9］Vainio E J，Hantula J.Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gelelectrophoresis of amplified ribosomal DNA［J］.Mycological Research，2000，104(8):927-936.

［10］Sandhu G S，Kline B C，Stockman L，et al.Molecular probes for diagnosis of fungal infections［J］.J Clin Microbiol，1995，33(11):2913-2919.

［11］李德舜，曹新紅，蘇靜，王臻，等.平菇黃腐病病原菌分離與鑒定［J］.山東大學學報:理學版，2008，43(1):4-7.

［12］Moyer C L，Tiedje J M，Dobbs F C，et al.A computer-simulated restriction fragment length polymorphism analysis of bacterial small-subunit rRNA genes:efficacy of selected tetrameric restriction enzymes for studies of microbial diversity in nature［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(7):2501-2507.

［13］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplifued genes coding for 16SrRNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［14］Heuer H，Krsek M，Baker P，et al.Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding16SrRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients［J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63(8):3233-3241.

［15］Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.Microbiol Rev，1995，59(1):143-169.

［16］Pace N R.A molecular view of microbial divesity and the biosphere［J］.Science，1997，276:734-740.

［17］Ivors K L，Collopy PD，Beyer D M，et al.Identification of bacteria in mushroom compost using ribosomal RNA sequence［J］.Compost Science and Utilization，2000，8(3):247-253.

［18］Blanc M，Marilley L，Beffa T，et al.Thermophilic bacterial communities in hot composts as revealed by most probable numbet counts and molecular(16SrDNA)methods［J］.FEMSMicrobiology Ecology，1999，28:141-149.

［19］Purdy K J，Embley T M，Takii S，et al.Rapid extraction of DNA and rRNA from sediments by a novel hydroxyapatite spin-column method［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(10):3905-3907.

［20］Kuske C R，Banton K L，Adorada D L，et al.Small-scale DNA sample preparation methods for field PCR detection of microbial cells and spores in soil［J］.Applied and Environmental Microbiology，1998，64(7):2463-2472.

［21］Zhou Jizhong，Bruns M A，Tiedje JM.DNA recovery from soil of diverse compisition［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(2):316-1322.

［22］汪小全，周喻年，張大明，等.RAPD應(yīng)用于遺傳多樣性和系統(tǒng)學研究中的問題［J］.植物學報，1996，38(12):954-962.

［23］Wikstr?m P，Wiklund A，Andersson A C，et al.DNA recovery and PCR quantification of catechol 2，3-dioxygenase genes from different soil types［J］.Journal of Biotechnology，1996，52:107-120.

［24］Kowalchuk G A，Naoumenko Z S，Derikx PJL，et al.Molecular analysis of ammonia-oxidizing bacteria of theβsubdivision of the class proteobacteria in compost and composted materials［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(2):396-403.