白僵菌Bb08-12菌株生物學(xué)研究及其對(duì)美國(guó)白蛾的致病性

劉寶生, 谷希樹, 許靜楊, 胡 霞, 孫淑琴, 白義川

(天津市植物保護(hù)研究所,天津 300112)

白僵菌Bb08-12菌株生物學(xué)研究及其對(duì)美國(guó)白蛾的致病性

劉寶生, 谷希樹, 許靜楊, 胡 霞, 孫淑琴, 白義川

(天津市植物保護(hù)研究所,天津 300112)

對(duì)采自美國(guó)白蛾僵蟲的蟲生真菌Bb08-12菌株進(jìn)行了生物學(xué)研究及致病性測(cè)定。根據(jù)該菌株的形態(tài)特征將其初步鑒定為球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。室內(nèi)測(cè)定結(jié)果表明:該菌株在26℃恒溫、高濕度下對(duì)1齡中期美國(guó)白蛾幼蟲具有較強(qiáng)的致病力。107孢子/mL劑量飼毒處理幼蟲72～120 h,幼蟲死亡率可達(dá)25.47%～79.32%,120 h的LC50為1.169×106孢子/mL。該菌株在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)差異明顯。沙氏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高,10 d產(chǎn)孢量可達(dá)到5.59×108孢子/cm2,極顯著高于PSA、查彼培養(yǎng)基和5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量。24 h光照和24 h黑暗兩處理間的菌落生長(zhǎng)量差異不明顯,而在培養(yǎng)的最初48 h,24 h黑暗處理可顯著促進(jìn)分生孢子萌發(fā)。

美國(guó)白蛾; 白僵菌生物學(xué)特性; 致病性測(cè)定

美國(guó)白蛾(Hyphantria cuneaDrury)原產(chǎn)于北美,屬鱗翅目燈蛾科(Arctiidae),是國(guó)際檢疫性對(duì)象。在北緯19°～55°廣大地區(qū)均有分布。主要為害闊葉樹種,嚴(yán)重時(shí)食光葉片導(dǎo)致整株樹木枯死[1],是我國(guó)林業(yè)病蟲害防控的重要對(duì)象。從20世紀(jì)80年代已經(jīng)開始對(duì)美國(guó)白蛾生物防治技術(shù)基礎(chǔ)與應(yīng)用展開研究并取得了重大成果[2]。然而利用白僵菌防治美國(guó)白蛾的基礎(chǔ)與應(yīng)用技術(shù)研究才剛剛起步,研究報(bào)道的文獻(xiàn)不多。2008年12月陸秀君等人報(bào)道了對(duì)美國(guó)白蛾高毒白僵菌菌株的篩選及與化學(xué)藥劑相容性研究結(jié)果[3]。本文作者對(duì)采自天津市美國(guó)白蛾幼蟲的白僵菌Bb08-12菌株進(jìn)行了形態(tài)初步鑒定、生物學(xué)特性與致病性測(cè)定?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌源

供試菌株為筆者2008年10月采自天津市農(nóng)科院北區(qū)白蠟林地美國(guó)白蛾罹病蟲尸。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)用培養(yǎng)基種類[4-5]如下。

沙氏(SDAY)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,葡萄糖40 g,酵母膏2 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL,調(diào)pH為5.6。

查彼(Czapek)培養(yǎng)基:硝酸鈉2.00 g,磷酸二氫鉀1.00 g,氯化鉀0.50 g,硫酸鎂0.50 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖 30.00 g,瓊脂粉 17～20 g,蒸餾水1 000 mL。

5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基:50 g麩皮放入1 000 mL水中煮30 min,過濾,補(bǔ)足水量至1 000 mL,然后加入20 g蔗糖、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂粉18 g,加熱至培養(yǎng)基成分完全溶解后再補(bǔ)充一次水至1 000 mL,過濾、分裝至三角瓶,高壓滅菌備用。

5%麩皮-蔗糖液體培養(yǎng)基:為不含瓊脂粉的5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基配方,制作過程與5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基相同。

1.3 菌種分離、純化

用無菌水沖洗下僵蟲的白色菌粉,配制成菌懸液并充分搖蕩,逐漸稀釋,涂布于沙氏平板滅菌培養(yǎng)基上,26℃下恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d左右,挑取單個(gè)微小白色菌落,接入滅菌的試管斜面沙氏培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)菌落占到斜面的2/3時(shí)置于低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 形態(tài)學(xué)鑒定

采用載玻片直接培養(yǎng)法[6]。培養(yǎng)3 d左右,可觀察到成熟的分生孢子及分生孢子梗,進(jìn)行顯微測(cè)量與照相。

1.5 不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察及菌落生長(zhǎng)量測(cè)定

菌落形態(tài)觀察:用20 d菌齡的白僵菌菌粉制備懸浮液;用接種針蘸取懸浮液點(diǎn)接于90 mm平板培養(yǎng)基上,置于有人工光照的培養(yǎng)箱內(nèi)26℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察菌落形態(tài)。

生長(zhǎng)量測(cè)定:用20 d白僵菌菌粉制備懸浮液。用接種針蘸取懸浮液點(diǎn)接于90 mm平板培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)箱內(nèi)全暗26℃恒溫培養(yǎng),接菌后第8天采用十字交叉法各測(cè)量一次菌落直徑,每處理重復(fù)4次,進(jìn)行方差分析。

產(chǎn)孢量測(cè)定按文獻(xiàn)[7]法,計(jì)算公式:1 cm2菌落孢子數(shù)量=(平均每個(gè)小格孢子數(shù)量×4×106×稀釋倍數(shù))/(3.14×r2×n),r為菌落半徑(cm),n為菌落的數(shù)量(塊)。

1.6 不同光照條件下白僵菌菌落生長(zhǎng)量及孢子萌發(fā)的測(cè)定

菌落生長(zhǎng)量:測(cè)定全暗和全光條件下白僵菌Bb08-12菌落的生長(zhǎng)速度。用20 d菌齡的白僵菌菌粉制備懸浮液;用接種針蘸取懸浮液點(diǎn)接于沙氏平板培養(yǎng)基中置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),第4天開始測(cè)量直徑,每個(gè)處理8次重復(fù)取平均值,并進(jìn)行方差分析。

孢子萌發(fā)測(cè)定:用10 d菌齡的白僵菌菌粉適量放入等量的 5%麩皮-蔗糖液體培養(yǎng)基中,振蕩15 min,置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),全光、全暗(用紙包裹嚴(yán)密)處理。測(cè)定培養(yǎng)24、48、72 h的孢子萌發(fā)率,其方法為:在16×40的視野下鏡檢孢子數(shù)量和萌發(fā)的孢子數(shù)量。萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn):芽管長(zhǎng)度超過或等于孢子的最小半徑時(shí)判定為萌發(fā)。各處理的孢子懸浮液鏡檢前搖勻,每處理隨機(jī)測(cè)5個(gè)視野,每個(gè)視野的孢子數(shù)量以40～50個(gè)左右為宜,密度大時(shí)可在載玻片上加水稀釋。取5次重復(fù)平均值,并進(jìn)行方差分析。

1.7 白僵菌Bb08-12菌株對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲致病性測(cè)定

2009年5月21日采集田間白蠟樹葉片上的美國(guó)白蛾1齡中期幼蟲,體長(zhǎng)5～6 mm。每處理3次重復(fù),每重復(fù)20頭左右,待幼蟲取食20 h左右穩(wěn)定后再飼喂帶毒葉片。

白僵菌Bb08-12菌株孢子懸浮液的制備:用沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的分生孢子粉加0.05%吐溫-80 配成 107、106、105、104、103孢子/mL 5 個(gè)濃度梯度,0.05%吐溫-80清水為空白對(duì)照。

帶毒葉片飼喂處理:把新鮮白蠟葉片洗凈,靜置30～40 min,風(fēng)干葉面水分,在不同劑量白僵菌懸浮液中浸濕后陰干葉面水分,即成帶毒葉片。用不同劑量帶毒葉片飼喂備好的美國(guó)白蛾幼蟲,每皿20頭左右。培養(yǎng)皿內(nèi)底層墊3～4層面巾紙,并滴加適量清水(以不能控出水為宜),使培養(yǎng)皿內(nèi)保持高濕狀態(tài),紙上鋪帶毒白蠟葉片,接入已穩(wěn)定取食的美國(guó)白蛾幼蟲,培養(yǎng)皿蓋與底之間加面巾紙密封防幼蟲逃走,然后置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi);每天調(diào)查幼蟲死亡情況,逐日調(diào)查5 d,適時(shí)更換帶毒葉片。

統(tǒng)計(jì)各處理和空白對(duì)照的逐日幼蟲死亡率,對(duì)各處理死亡率進(jìn)行方差分析。

應(yīng)用DPS軟件計(jì)算毒力回歸方程及 LC50和相關(guān)系數(shù)[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

從美國(guó)白蛾幼蟲僵尸分離、純化得到編號(hào)為Bb08-12的白僵菌菌株,直接鏡檢可見:分生孢子梗單生,呈瓶狀;孢子梗的瓶體形狀從基部顯著膨大到細(xì)長(zhǎng)瓶形不等(見圖1,圖2)。分生孢子生在“之”字形小梗上(見圖2),多數(shù)為圓球形,少數(shù)卵圓形,無色 、單胞,直徑大小為 1.61～3.18 μ m,平均直徑2.23 μ m。由此形態(tài)特征,根據(jù)文獻(xiàn)[7-8,10]初步鑒定為真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、白僵菌屬、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

2.2 不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察及菌落生長(zhǎng)量、產(chǎn)孢量的測(cè)定

2.2.1 不同培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)

白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同,其各自特點(diǎn)見表1。

表1 白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2.2 白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量

從表2結(jié)果看出:該菌株菌落生長(zhǎng)量在4種培養(yǎng)基上有顯著和極顯著差異。菌落在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極顯著快于沙氏培養(yǎng)基上,顯著快于5%麩皮-蔗糖培養(yǎng)基,但與5%麩皮-蔗糖和查彼培養(yǎng)基相比無極顯著差異;在查彼(Czapek)培養(yǎng)基和5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)量差異不顯著。

產(chǎn)孢量測(cè)定結(jié)果表明,在沙氏培養(yǎng)基上該菌株產(chǎn)孢量極顯著高于其他3個(gè)培養(yǎng)基,而這3個(gè)培養(yǎng)基之間的產(chǎn)孢量沒有極顯著差異。其次,5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量顯著高于查彼(Czapek),但與PSA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量相比無顯著差異;PSA培養(yǎng)基和查彼的產(chǎn)孢量無顯著差異。

表2 白僵菌Bb08-12在不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d菌落生長(zhǎng)量及10 d產(chǎn)孢量

2.3 不同光照條件下Bb08-12菌株菌落生長(zhǎng)量及孢子萌發(fā)率

表3結(jié)果表明:不同光照條件對(duì)白僵菌菌落生長(zhǎng)沒有顯著影響。在培養(yǎng)的最初24、48 h,全黑暗條件下白僵菌分生孢子萌發(fā)率(分別為47.10%,83.36%)顯著高于全光條件下相應(yīng)處理(26.01%,61.46%);培養(yǎng)至72 h,全光和全黑暗條件下分生孢子萌發(fā)率不再有顯著差異。由此表明,在最初培養(yǎng)48 h內(nèi),全黑暗較全光條件可顯著促進(jìn)白僵菌分生孢子的萌發(fā)。

表3 不同光照條件下白僵菌Bb08-12菌株菌落生長(zhǎng)量和分生孢子萌發(fā)率1)

2.4 白僵菌Bb08-12菌株對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的致病性

從表4結(jié)果看出,白僵菌對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲的致病死亡率隨孢子懸浮液中孢子含量和持續(xù)時(shí)間而增加。飼毒處理后的72～120 h,幼蟲死亡率顯著提高。在 26℃恒溫、皿內(nèi)高濕度下,球孢白僵菌Bb08-12菌株在107孢子/mL劑量下,對(duì)1齡中期美國(guó)白蛾幼蟲120 h的毒力回歸方程、LC50和相關(guān)系數(shù)R分別為y=0.516 7x+1.865 1、1.169×106孢子/mL和0.947 3。

表4 白僵菌Bb08-12菌株對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲致病性測(cè)定結(jié)果1)

3 討論

本文對(duì)白僵菌Bb08-12菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定,球孢白僵菌僅為初步結(jié)果。后續(xù)研究中將采用核酸序列分析進(jìn)行分子鑒定。

林華峰等人[5]研究證明,濕度是白僵菌孢子萌發(fā)和侵染致病的主要制約因子。在溫度達(dá)10℃以上,相對(duì)濕度達(dá)95%時(shí)白僵菌對(duì)松毛蟲的侵染致病效應(yīng)更為顯著。因此,本研究致病性測(cè)定中,采用1.7方法使皿內(nèi)小環(huán)境在26℃恒溫下維持高濕狀態(tài),因條件所限未能測(cè)定相對(duì)濕度數(shù)值。

沙氏培養(yǎng)基是目前保存和培養(yǎng)白僵菌最常用的培養(yǎng)基[6],本研究結(jié)果也證明該培養(yǎng)基有利于白僵菌產(chǎn)孢,此結(jié)果與李會(huì)平研究結(jié)果[8]不同,是否與所用白僵菌菌株有關(guān),有待研究。此外,本研究發(fā)現(xiàn),在最初培養(yǎng)的48 h內(nèi),黑暗處理的分生孢子萌發(fā)率顯著高于光照處理的萌發(fā)率;隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),黑暗處理與光照處理的萌發(fā)率差異不再顯著。這與李會(huì)平研究結(jié)果是一致的,進(jìn)一步證明了黑暗處理能夠促進(jìn)白僵菌分生孢子的萌發(fā)[9],為白僵菌生產(chǎn)中培養(yǎng)液體菌種、優(yōu)化發(fā)酵條件提供了依據(jù)。

[1]劉代文,李紅,段學(xué)慧.天津地區(qū)美國(guó)白蛾的生活習(xí)性及生物防治[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,11(1):40-42.

[2]張彥龍,武三安,郭文霞,等.中國(guó)美國(guó)白蛾生物防治研究進(jìn)展[J].河北林果研究,2008,23(1):70-77.

[3]陸秀君,李瑞軍,董立新,等.美國(guó)白蛾高毒白僵菌菌株篩選與高效氯氰菊酯的相容性[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2008,35(6):575-576.

[4]方中達(dá).植病研究方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[5]林華峰,樊美珍,李增智,等.不同溫濕度下白僵菌對(duì)松毛蟲的侵染致病效應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),1998,9(2):195-200.

[6]陳聲明,張立欽.微生物學(xué)研究技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,2006.

[7]幸興球.白僵菌的調(diào)查和鑒定[J].昆蟲知識(shí),1976,13(3):183-174.

[8]路國(guó)兵,王更先,韓景瑞,等.白僵菌菌株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)蠶業(yè),2007,28(2):13-15,32.

[9]李會(huì)平.桑天牛幼蟲高致病性白僵菌菌株篩選及其致病機(jī)理研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[10]魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1979.

Biological characteristics and pathogenicity of Beauveria bassiana Bb08-12 to Hyphantria cunea larvae

Liu Baosheng, Gu Xishu, Xu Jingyang, Hu Xia, Sun Shuqin,Bai Yichuan
(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Biological characteristics and pathogenicity of the entomogenous fungi Bb08-12,isolated fromHyphantria cunealarvae,toH.cuneawere investigated in this study.The strain Bb08-12 was primarily identified asBeauveria bassianaaccording to its morphology.The results showed that the strain Bb08-12 had stronger pathogenicity toH.cuneaat higher humidity and constant temperature(26℃)in the laboratory.WhenH.cunealarvae were fed with leaves containing1×107spores/mL,the 25.47%-79.32%larvae were killed after 72-120 h.The LC50was 1.169×106spores/mL at 120 h.The colony forms ofB.bassianaBb08-12 were remarkably different on different culture media.The number of conidia on SDAY culture medium was the highest,reaching to 5.59×108spores/cm2in 10 days,which was significantly greater than that on PSA,Czapek and 5%bran-sucrose culture media.The growth rates of colonies were not remarkably different between 24 h-light and 24 h-darkness.Conidia germination was significantly improved in 24 h-darkness in the initial 48 h.

Hyphantria cunea; biological characteristic ofBeauveria bassiana; pathogenicity determination

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.032

2010-07-02

2010-09-28

天津農(nóng)科院院長(zhǎng)基金(09004)

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