骨碎補藥材HPLC指紋圖譜與鑒別

朱國嬋 李建明 邱連建 曾斌

骨碎補(Rhizoma Drynariae)名貴中藥材，是我院中藥制劑常用的中藥材，市售骨碎補藥材有12種之多［1］。本實驗研究以抽皮苷和新北美圣草苷為對照品，對10批不同產(chǎn)地的骨碎補藥材進行測定，初步建立了HPLC指紋圖譜，并進行方法學的考察，標出8個共有指紋峰，借此指紋圖譜鑒定市售骨碎補藥材的真假。

1 儀器與試藥

2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)。柚皮苷對照品(批號:110722-201002，中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。)新北美圣草苷(沈陽藥科大學藥學院提供純度98%以上)。甲醇為色譜純、乙醇、磷酸分析純，實驗用水(雙蒸水)。10批骨碎補藥材正品分別購自全國各地(見表1)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院張丹雁教授鑒定。另外，廣州市清平街市購買五個不同產(chǎn)地的骨碎補藥材作鑒別。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備 分別精密稱取干燥抽皮苷對照品和新北美圣草苷對照品5 mg和15 mg，分別置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，即得。精密稱取骨碎補藥材干粉1.0 g，置園底燒瓶加甲醇40 ml，熱回流3 h，冷卻后用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液置50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱:Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-0.1% 磷酸水(B)，二元梯度洗脫，洗脫程序:A:0 min 0%，5 min 5%，30 min 30%，45 min 50%，55 min 60%，70 min 50%;柱溫 28℃，流速:1 ml/min，檢測波長為283 nm。在此色譜條件下骨碎補的各色譜峰能較好分離，見圖1。

圖1 骨碎補HPLC指紋圖譜

2.3 樣品中主成分含量的測定

2.3.1 標準曲線繪制 分別精密吸取抽皮苷和新北美圣草苷對照品溶液 0.50、2.5、5.0、10、20、30 μl進樣，按 2.2 色譜條件測定各自峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各自標準曲線。結果:得回歸方程:Y抽=789.66 X抽+1234.09，γ 抽 ＞0.9988;Y 新 =665.33 X 新 +2244.16，γ 新＞0.9966。抽皮苷在0.05～3.00μg，新北美圣草苷在0.15～9.00μg進樣量與峰面積均呈良好的線性關系。

2.3.2 樣品含量測定 精密吸取上述對照品溶液和上述10批樣品的供試品溶液各10 μl，分別按照2.2色譜條件測定其各自峰面積，按2.3.1標準曲線計算，即得。詳見表1。

表1 10批不同來源骨碎補藥材中抽皮苷及主要成分含量測定結果

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取上述產(chǎn)地骨碎補中同一份供試品溶液連續(xù)進樣6次，每次10ul，結果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度＞0.9978，RSD＜1.8%，表明使用儀器精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性試驗 取上述產(chǎn)地骨碎補中某一樣品藥材5份，分別制備供試品溶液，分別依法測定，結果各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度＞0.9566，RSD＜2.0%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取上述某一供試品溶液，分別在制備后0、6、12、24、48 h進樣測定，結果指紋峰的相對保留時間和相對峰面積亦基本一致，相似度＞0.9788，RSD＜2.0%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 HPLC指紋圖譜的構建

2.5.1 共有指紋峰的標定 按照文獻［2］規(guī)定，以抽皮苷為參照物(S1)將各色譜峰保留時間與S1的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間。分別計算，經(jīng)過對照比較，其中8個色譜峰為槲蕨共有，相對保留時間為:，峰1(0.5287)，峰2(0.5411)，峰 3(0.6199)，峰 4(0.7455)，峰 5(0.8506)，峰6(0.9108)，峰7(1.0000)，峰 8(1.06891)為新北美圣草苷為參照物(S2)。因此標定它們?yōu)楣灿兄讣y峰見圖2和圖1。

圖2 10批骨碎補藥材的HPLC指紋圖譜

2.5.2 共有指紋峰的相對峰面積 根據(jù)參考文獻［2］和《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》把所有的峰面積全部標定并計算，各共有峰的相對峰面積依次為0.2729(1)、0.2144(2)、0.0209(3)、0.0398(4)、0.0158(5)、0.0188(6)、1.0000(S1)、0.9768(8)。(即 S2 新北美圣草苷)。其中 1、2、8 的峰面積均超過7號峰(抽皮苷峰)的10%。詳見圖1。這就作為定性鑒別骨碎補的依據(jù)。

2.6 廣州外買五批骨碎補藥材的鑒別 分別取五批外買供試品細粉各1.0 g，精密稱定，按“2.1”條制備供試品溶液，在“2.2”色譜條件下測定其指紋圖譜，見圖3。

圖3 五個不同來源骨碎補的HPLC指紋圖譜比較

3 討論

本文建立了骨碎補中藥材HPLC指紋圖譜，與文獻［1，3］報導用幾種不同色譜條件建立的指紋圖譜相比，共有指紋峰均為8個，反映的化學成分信息相當。經(jīng)對照品比較，確定7號峰為抽皮苷(S1)、8 號峰為新北美圣草苷(S2)，1、2、3、4、5、6均為骨碎補藥材的有效化學成分。本文把它當作骨碎補藥材指紋圖譜的共有模式(圖2)，并把它作為定性定量檢測鑒定骨碎補藥材的真假，評價其外在內(nèi)在質(zhì)量的依據(jù)。

廣州市清平街市購買的五批骨碎補藥材，經(jīng)本骨碎補藥材的HPLC指紋圖譜(圖2)比較鑒別，其中四批為非正品，因為共有指紋峰數(shù)不符，A、B、C各指紋峰的相對保留時間和峰面積無法匹配，更無法評價其相似度，其中D產(chǎn)品9個共有指紋峰中有7個可匹配，但其各峰相似度均小于0.7，所以為非正品。E產(chǎn)品8個共有指紋峰的相對保留時間和峰面積與(圖2)可以匹配，其相似度大于0.9。而且抽皮苷含量0.74%，新北美圣草苷含量0.55%，即其主成分含量1.29%，在指紋圖譜共有模式的測定范圍之內(nèi)。被認定為骨碎補正品。這比上世紀末骨碎補類生藥商品調(diào)查使用的性狀鑒定或顯微鑒定研究方法先進、科學、準確、快速。與熊明玲［4］報導一致，但色譜條件不同其指紋圖譜各異。

［1］劉惠平，劉曼，李超，李發(fā)美.骨碎補藥材的高效液相指紋圖譜.沈陽藥科大學報，2008，25(2):133-136.

［2］ 蔡寶昌，劉訓紅.常用中藥材HPLC指紋圖譜測定技術.北京，化學工業(yè)出版社，2005:22-25.

［3］李順祥，張志光，龍勉，等.骨碎補超微飲片的HPLC指紋圖譜研究.中草藥，2005，36(11):1634-1637.

［4］熊明玲，劉凱南，高厚明，劉紀青.骨碎補高效液相指紋圖譜的構建與應用.中國藥業(yè)，2011，20(5):4-6.