Biolog生態(tài)板的應用原理及碳源構(gòu)成

孔 濱，楊秀娟

（曲阜師范大學資產(chǎn)管理處，山東 曲阜 273165）

1 引言

在過去大量的研究中，SCU方法多是利用革蘭氏陰性板（Gram-negative plates，簡稱GN板），該板由95種碳源組成，最早設(shè)計主要是用于細菌的鑒定［1］。之后，為了研究的需要，設(shè)計了生態(tài)板（Ecology plates，簡稱ECO板），ECO板有31種碳源，其中的6種碳源在GN板中沒有，至少有9種是根系分泌物的組分，ECO板相對于GN板利用了更多生態(tài)有關(guān)的化合物，更適合于土壤微生物群落功能多樣性研究，并且由于節(jié)省了碳源，每塊板可以同時完成3個重復，降低了使用成本。

2 Biolog生態(tài)板研究環(huán)境微生物群落

2.1 微生物代謝中的氧化-還原反應

新陳代謝簡稱代謝，是生物體表現(xiàn)其生命活動的重要特征之一。代謝包括數(shù)以千計的不同酶的催化反應，這些復雜的酶促進有機反應的實現(xiàn)，多是經(jīng)過反應部位的接近和取向的效應，形成過渡態(tài)而發(fā)生的。氧化-還原反應是生物代謝過程中的一類重要反應，其實質(zhì)是電子的得失，電子從電子供體傳遞給電子受體。當代謝物被氧化，兩個電子通常同時傳遞，并伴隨著底物兩個質(zhì)子（H+）的釋放。底物的氧化作用亦稱作脫氫反應，其形式上等同于兩個氫質(zhì)子的釋放［2］。列舉一反應式說明其過程：

此反應中一個氫質(zhì)子及一對電子從底物傳遞至吡啶環(huán)，另一個氫成為溶液中的質(zhì)子。

2.2 四唑紫染料顯色反應

四唑染色測定法于1942年由德國萊康（H.Lakon）教授發(fā)明，其原理是根據(jù)四唑鹽類由原初氧化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)時呈現(xiàn)明顯的顏色（粉紅色，紫色，紅色，藍紫色和藍色）變化，來直接檢測生化代謝活性。

氯化3-（1-萘基）-2，5-二苯基-2H-四唑鎓（Tetrazolium violet，四唑紫）是一種常用的四唑鹽，在氧化-還原反應發(fā)生的基質(zhì)脫氫（包括脫電子）生化反應過程中，四唑紫能夠優(yōu)先得到電子顯示紫色，得電子越多，紫顏色越深。細菌代謝所需的能量主要是從生物氧化作用獲得，生物學底物在生物體內(nèi)氧化分解的過程，主要以脫氫和失電子的方式進行。因此，應用四唑鹽顯色法可以用來評價細菌的代謝活力。細菌利用碳源的能力越大，則紫色越深。四唑紫顯色反應過程如下：

2.3 Biolog生態(tài)板的應用原理

ECO板上有96個微孔，每32個孔為1個重復，每板共計3個重復。32個微孔中除對照孔外各個孔內(nèi)都含有一種不同的有機碳源和相同含量的四唑紫染料。將微孔內(nèi)的有機碳源作為微生物的唯一能量來源，微生物接種到微孔板上的孔中后，若能利用碳源，即能夠?qū)ζ溥M行生物氧化，有電子轉(zhuǎn)移，四唑紫就能優(yōu)先俘獲電子而變成紫色。顏色的深淺反映了微生物對相應碳源的利用能力。通過Biolog系統(tǒng)的微平板讀數(shù)器，測定ECO板在590nm波長下的光密度值（OD值），完成數(shù)據(jù)的采集與存儲。運用主成分分析（PCA）或相似類型的多變量統(tǒng)計分析方法展示不同微生物群落產(chǎn)生的代謝特征指紋（Metabolic Profiles）。其理論依據(jù)是Biolog代謝類型的變化與群落組成的變化相關(guān)［3］。

3 Biolog生態(tài)板碳源分類與性質(zhì)

利用Biolog方法對不同研究對象進行測定時，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量非常大，為了充分挖掘隱含在實驗數(shù)據(jù)中的信息，闡明不同微生物群落對不同碳源的利用差異，首先需要弄清ECO板的碳源結(jié)構(gòu)，對微平板內(nèi)31種有機碳源進行分類，為后續(xù)統(tǒng)計分析、解釋實驗結(jié)果作參考。

結(jié)合有機化合物化學官能團、微生物生理代謝途徑和生態(tài)功能3個方面，將ECO板的31種碳源底物分為6大類［1］：糖類及其衍生物，羧酸，氨基酸，多聚物，酚酸類和胺類（表1）。

3.1 糖類及其衍生物

從化學結(jié)構(gòu)講，糖類化合物是多羥基的醛或酮。以多聚物形式存在的葡萄糖和其他糖類不僅是自然界礦化過程的主要物質(zhì)，而且它們也以單體的形式存在，是大多數(shù)異養(yǎng)微生物重要的有機營養(yǎng)物。在ECO板中，將12種有機碳源歸屬于糖類及其衍生物中，并對其進行細化分類為7類。

表1 ECO板六類碳源

3.1.1 單糖及單糖磷酸酯

（1）D-木糖。在自然界較豐富，以多糖的形式存在于玉米芯、棉子殼、谷類秸稈中，是構(gòu)成半纖維素的重要單體之一。

（2）葡萄糖-1-磷酸。磷酸化的葡萄糖是糖酵解途徑的中間產(chǎn)物。

3.1.2 雙糖

（1）纖維二糖是纖維素的二糖單位，水解后得到兩分子的葡萄糖。微生物分解纖維素的酶具有可誘導性，但以葡萄糖為碳源的微生物產(chǎn)生的纖維素酶很少，如果加入以纖維素為主的底物可使其產(chǎn)生較多的纖維素酶。

（2）α-D-乳糖用酸或酶水解，得一分子D-半乳糖和一分子D-葡萄糖。這兩種水解產(chǎn)物均能直接進入糖代謝。

3.1.3 糖苷

β-甲基D-葡萄糖苷是具有β-苷鍵的糖類衍生物，可由纖維素酶進行分解。

3.1.4 糖醇

將糖分子上的醛基或酮基還原成羥基，就成糖醇。糖醇具有某些糖的屬性，是生物體的代謝產(chǎn)物。

（1）I-赤蘚糖醇。廣泛分布于水果、蘑菇、地衣等植物中。

（2）D-甘露醇。構(gòu)成針葉材半纖維素的重要單體，是某些微生物的良好培養(yǎng)基。

3.1.5 糖酸

（1）D-半乳糖醛酸。構(gòu)成聚半乳糖醛酸的構(gòu)件分子，聚半乳糖醛酸是果膠物質(zhì)的組分之一，主要存在于植物初生細胞壁和細胞之間的中層，在漿果、果實和莖中最豐富。

（2）D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯。是醛糖酸形成的穩(wěn)定分子內(nèi)酯，為半乳糖的氧化產(chǎn)物，糖代謝途徑的中間產(chǎn)物。

3.1.6 氨基糖

（1）N-乙酰-D-葡糖胺。它和D-乳糖反應形成的N-乙酰胞壁酸是細菌細胞壁結(jié)構(gòu)多糖的構(gòu)件分子之一。它也是幾丁質(zhì)、粘多糖、糖蛋白的單體之一。

（2）D-葡糖氨酸是D-葡糖胺氧化產(chǎn)物，屬于氨基糖的衍生物。

3.1.7 D，L-α-磷酸甘油

在糖酵解過程中，中間產(chǎn)物類磷酸二羥丙酮在甘油磷酸脫氫酶作用下可還原生成α-磷酸甘油；后者可進一步被甘油-1-磷酸酶水解為甘油和單磷酸?？烧J為D，L-α-磷酸甘油參與了糖的代謝過程，故把其放到糖類及其衍生物這一大類中?？梢夿iolog生態(tài)板所選擇的這些糖類及其衍生物很具有代表性，不但有常見的單糖和雙糖，還選取了可以較全面涵蓋不同種類的單糖的衍生物，這些都是聚糖的重要構(gòu)件分子或者參與糖代謝的中間體。

3.2 氨基酸

氨基酸是土壤有機氮的重要組成部分，是植物根系向土壤介質(zhì)中分泌的大量低分子有機化合物之一，微生物在生長代謝過程中，可利用氨基酸作為其氮源，合成植物生長調(diào)節(jié)劑，促進植物的生長［4］。

在ECO板中，選擇了5種常見的氨基酸和1種較為簡單的二肽。所選取的這5種較全面涵蓋了氨基酸的不同種類，具有一定的代表性。其中L-絲氨酸和L-蘇氨酸屬于含羥基的氨基酸，L-天冬酰胺酸屬于酸性氨基酸，L-精氨酸是堿性氨基酸，這4種都可歸為脂肪族氨基酸；L-苯基丙氨酸是芳香族氨基酸的一種。甘氨酰-L-谷氨酸水解可生成甘氨酸和谷氨酸，二者分別為中性和酸性氨基酸。

3.3 羧酸及其衍生物

羧酸是植物根系分泌物的重要組分，目前已知有丁酸、檸檬酸、反丁烯二酸、蘋果酸、丙酮酸、丁二酸等［5］。羧酸結(jié)構(gòu)中可含有烯鍵、羥基、酮基、環(huán)氧基等。

3.3.1 酮酸

丙酮酸甲酯的官能團為羰基和酯基，屬于羧酸衍生物，其水解產(chǎn)物之一的丙酮酸，和α-丁酮酸一樣，都屬于酮酸，為重要的代謝中間產(chǎn)物。酮酸是一類在生物體內(nèi)有重要作用的有機酸，在氨基酸新陳代謝和維持氧化還原狀態(tài)的過程中起重要作用。

3.3.2 羥基酸

（1）γ-羥基丁酸是一種效力強、快速作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑。γ-羥基酸易形成內(nèi)酯，γ-羥基丁酸形成的γ-丁內(nèi)酯在許多天然物質(zhì)和食品中都存在。

（2）蘋果酸又名2-羥基丁二酸，是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物，在蘋果酸-天冬氨酸循環(huán)中也起重要作用。D-蘋果酸是其一種右旋立體異構(gòu)體。

3.3.3 不飽和酸

衣康酸學名為亞甲基丁二酸，是一種不飽和二元有機酸，可由微生物經(jīng)發(fā)酵途徑生成。

3.4 多聚物

3.4.1 α-環(huán)式糊精

α-環(huán)式糊精是淀粉經(jīng)某種特殊酶水解得到的環(huán)狀低聚糖，由6個葡萄糖基通過α-1，4-苷鍵結(jié)合而成。含有6個、7個或8個葡萄糖單位的相應稱為α-、β-和γ-環(huán)糊精。環(huán)式糊精的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有剛性，不易反應，對α-淀粉酶及β-淀粉酶有很大的阻抗性。

3.4.2 肝糖

肝糖又稱糖原，相對分子質(zhì)量約為2.7×105～1.0×108左右。糖肝可在細菌和個別植物中找到。

3.4.3 吐溫40和吐溫80

吐溫的化學名稱為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡稱聚山梨酯。根據(jù)山梨醇與高級脂肪酸所形成的酯的不同，吐溫可有同類型的系列產(chǎn)品，如吐溫40（棕櫚酸酯）、吐溫80（油酸酯）。吐溫40中的棕櫚酸為飽和脂肪酸，吐溫80中的油酸為不飽和脂肪酸。在進行解脂微生物的分離時，可將吐溫作為底物。例如：利用固體平板變色圈法，以吐溫為底物，尼羅藍（Nile blue）作為指示劑，根據(jù)變色圈大小來判斷解脂細菌活性的高低。

3.5 酚酸類

3.5.1 2-羥基苯甲酸

2-羥基苯用酸又名水楊酸，存在于自然界的柳樹皮、白珠樹葉及甜樺樹中。它有多種用途，是制染料、香料的重要原料，并可用作食物防腐劑。

3.5.2 4-羥基苯甲酸

4-羥基苯用酸也可稱為對羥基苯甲酸，是小麥及其他作物根系分泌物和根茬腐解液中的主要化學成分，對大豆、花生、煙草等經(jīng)濟作物具有較強的化感作用，可導致作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣、生育狀況變差、病蟲害發(fā)生嚴重等現(xiàn)象［6］。

3.6 胺類

氨分子里的氫被烴基或其它非酸性有機基團取代后衍生出的一類有機化合物。胺類大多具有堿性，能與酸結(jié)合成鹽。胺在自然界中分布很廣，其中大多數(shù)是由氨基酸脫羧生成的。

3.6.1 苯乙胺

苯乙胺是一種生物堿，具有魚腥味?？捎杀奖彼嵬ㄟ^脫羧作用的方式生化合成。它可以在很多食物中找到。

3.6.2 腐胺

腐胺也被命名為1，4-丁二胺，是由生物的活體或尸體中蛋白質(zhì)的鳥氨酸脫羧產(chǎn)生。是廣泛存在于原核生物及真核生物中的生物活性物質(zhì)。

4 主成分分析（PCA）方法及其在Biolog數(shù)據(jù)分析中的應用

ECO板的結(jié)構(gòu)決定了Biolog試驗獲得的數(shù)據(jù)多，因此直觀上很難比較各處理間存在的差異。為研究環(huán)境微生物對不同碳源利用能力的差異，從而達到全面了解微生物群落代謝功能特征的目的，研究者常用主成分分析法（Principal Component A-nalysis，PCA）進行分析。

4.1 闡述主成分分析法的原理

主成分分析的基本思想就是降維，用降維分析技術(shù)來解釋原變量的協(xié)方差結(jié)構(gòu)，即一種將原來眾多且相關(guān)變量所蘊含的信息集中到少數(shù)幾個相互獨立的綜合因子，所得的綜合因子為原來變量的線性組合，保留了原始變量的主要信息（變異的主要部分），而且彼此之間不相關(guān)［7］。

對于一個有n個變量x1，x2，...，xn的多維空間，PCA方法可構(gòu)造n個新變量，稱為主成分得分（簡稱主成分）t1，t2，……，tn。主成分必須滿足以下條件：每個主成分是各個原變量的線性組合；各個主成分之間為正交；經(jīng)線性交換得到的t1的方差為最大，t2次之，依次類推，t1，t2，……，tn，稱為第1，2，……，n主成分。一般而言，方差大的主成分含原變量的信息量大，因此t1所含原變量的信息量最大，t2次之，余類推。一般情況下，前面幾個主成分的方差貢獻率已足夠大，可基本反映原變量的信息。這樣原來多維空間的大部分信息可由前面幾個主成分組成的低維（二維或三維）空間表現(xiàn)出來［8］。

主成分的基本性質(zhì)［9］包括各主成分是相互獨立的；由標準化原指標求主成分的系數(shù)就是各主成分相應的特征向量（Eigenvector）；主成分的方差是相關(guān)矩陣的特征根或特征值（Eigenvalue），即綜合因子。在分析時只要由大到小選擇前幾個主成分分析其意義就可以。

某個主成分的貢獻率（Proportion）=該主成分的方差／全部主成分的方差之和 ×100%；前P個主成分的累積貢獻率（Cumulative Proportion）為前P個主成分貢獻率之和。實際應用中，一般取累積貢獻率為70%～85%或以上所對應的前P個主成分即可。主成分負荷量的大小和它前面的正負號直接反映了主成分與相應變量之間關(guān)系的密切程度和方向，系數(shù)的絕對值越大，說明該主成分受該指標的影響也就越大。

4.2 主成分分析法在Biolog分析中的應用

選取Gomez E［10］利用Biolog ECO板研究施有機肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響的實驗，具體展現(xiàn)主成分分析法在Biolog數(shù)據(jù)分析中的應用。實驗設(shè)3個處理：施農(nóng)家堆肥（HSW），馬和兔子糞肥（HRM），雞糞肥（CM），并取未擾動土壤（C）作為對照。對實驗數(shù)據(jù)進行主成分分析，過程如下。

（1）提取主成分。10Mg ha-1條件下提取的第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別可以解釋36.8%和12.1%原變量特征，20Mg ha-1條件下，PC1和PC2分別為38.8%和10.4%。

（2）利用PC1和PC2做出二維圖形，直觀表示各處理之間的差異。

（3）在統(tǒng)計軟件出來的結(jié)果中找出與PC1和PC2具有較高相關(guān)系數(shù)的碳源，以明確造成二維圖中差異的特征碳源基質(zhì)。10Mg ha-1與20Mg ha-1條件下，與PC1相關(guān)性較高的碳源為D-半乳糖內(nèi)酯、丙酮酸甲脂、D-木糖、吐溫-80、D-甘露醇、4-羥基苯甲酸；與PC2相關(guān)性較高的碳源為α-D-乳糖。

5 結(jié)語

對研究者來說，Biolog方法要求的勞動強度、技術(shù)含量都較低，只需對Biolog微平板進行無菌接種操作即可，并且可以在較短的時間內(nèi)檢測較大量的樣品。只要數(shù)據(jù)分析正確，培養(yǎng)時間合適，該方法在研究微生物群落功能多樣性方面很有意義。在實際應用過程中，Biolog方法最好結(jié)合其他微生物生態(tài)學的研究方法（如DGGE和PLFA法）一起使用，以避免由于方法原理本身帶來的偏差。

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