噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

王凱，劉洪艷，牟玲

(沈陽(yáng)市傳染病院腎綜合征出血熱研究所，遼寧沈陽(yáng)110006)

20世紀(jì)80年代，隨著DNA重組技術(shù)的不斷發(fā)展和抗體基因結(jié)構(gòu)的闡明，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)。近年來(lái)，治療性單克隆抗體發(fā)展迅速，已成為免疫治療的重要手段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前有22個(gè)單克隆抗體已經(jīng)在美國(guó)被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床治療，超過(guò)200個(gè)單克隆抗體已在臨床實(shí)驗(yàn)階段，并且保持著每年約14%的增長(zhǎng)率［1-2］?？贵w庫(kù)技術(shù)問(wèn)世已20余年，該技術(shù)為基因工程抗體領(lǐng)域帶來(lái)了廣闊的應(yīng)用前景?？贵w庫(kù)技術(shù)的核心是通過(guò)表型與基因型的偶聯(lián)，從構(gòu)建的抗體庫(kù)中找到編碼針對(duì)特異抗原的基因?？贵w庫(kù)技術(shù)由于篩選容量大、篩選能力強(qiáng)，可在體外表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，便于大規(guī)模生產(chǎn)，最有意義的是該技術(shù)可直接改善抗體的性能，獲取高親和力的抗體，因而成為開(kāi)發(fā)抗體藥物最具發(fā)展活力的領(lǐng)域［3-4］。

1 噬菌體抗體庫(kù)的基因來(lái)源

已構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)根據(jù)其來(lái)源可分為2大類，一類為免疫抗體庫(kù)，另一類為非免疫抗體庫(kù)。免疫抗體庫(kù)的抗體基因來(lái)源于抗原免疫的個(gè)體，因此不需要很大的庫(kù)容量即可從該類抗體庫(kù)中篩選到針對(duì)某一抗原的特異性抗體。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗體庫(kù)制備針對(duì)弱抗原、自身抗原及具有毒性抗原的抗體均無(wú)效，而且某一特定的抗體庫(kù)只能產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的抗體，不能作為一個(gè)廣泛應(yīng)用的平臺(tái)［5］。

非免疫抗體庫(kù)不針對(duì)特定抗原，而是作為一個(gè)無(wú)偏向性的篩選平臺(tái)，因此必須具有很高的庫(kù)容量和多樣性［6］。目前，通過(guò)不同途徑得到的非免疫抗體庫(kù)有天然抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和全合成抗體庫(kù)。

天然抗體庫(kù):其基因主要來(lái)源于B細(xì)胞，包括前、成熟、記憶B細(xì)胞，常從骨髓、脾、淋巴結(jié)、外周血中提取。為了獲取抗體基因，通常有3種設(shè)計(jì)思路:①在框架區(qū)FRl和FR4或J區(qū)(鉸鏈區(qū))設(shè)計(jì)引物，但此方法在引物區(qū)引入的氨基酸的突變可能對(duì)抗體的親和力有潛在影響;②設(shè)計(jì)套式PCR引物，先在信號(hào)肽和C區(qū)設(shè)計(jì)引物，克隆后測(cè)序，再在FR1和FR4區(qū)根據(jù)測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)引物，可獲得完全真實(shí)的V區(qū)序列，但信號(hào)肽序列變化較大，不易設(shè)計(jì);③5＇-RACE或3＇-RACE，其中的特異引物可針對(duì)C區(qū)或polyA區(qū)，用此方法也可獲得完全真實(shí)的V區(qū)序列，而且不易漏過(guò)可用的抗體基因，可用于通用引物無(wú)法擴(kuò)增的雜交瘤細(xì)胞，但操作比較繁瑣［7-9］。

半合成抗體庫(kù):以人工合成的部分可變區(qū)序列與另一部分天然序列組合。Ig輕重鏈各有3個(gè)高變區(qū)，其中由V(D)J基因在B細(xì)胞個(gè)體發(fā)生過(guò)程中重組形成的CDR3，序列變化大，特別是其長(zhǎng)度，是決定抗體特異性的最重要因素，可從5個(gè)氨基酸到30多個(gè)氨基酸殘基。人胚系可變區(qū)的基因(含CDR1和CDR2)與通過(guò)人工合成編碼氨基酸的隨機(jī)引物置換的可變區(qū)中的CDR3組合，在體外模擬V(D)J重組構(gòu)建，成為半合成抗體庫(kù)。Winter小組［10］在最初的探索中，采用49個(gè)胚系的VH和人工合成的CDR3重組，配以單個(gè)Vk基因，構(gòu)建成庫(kù)容為2×107的抗體庫(kù)，后經(jīng)改造，采用組合感染法，得到庫(kù)容達(dá)6.5×1010的總抗體庫(kù)，成功地篩選到了多種特異性抗體。

全合成抗體庫(kù):此抗體庫(kù)的出現(xiàn)得益于人類對(duì)抗體基因越來(lái)越深入的了解。全合成抗體庫(kù)人為地對(duì)抗體序列尤其是關(guān)鍵部位氨基酸序列進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，減少無(wú)效克隆的產(chǎn)生，可獲得大量有功能抗體，從而表現(xiàn)出良好的發(fā)展優(yōu)勢(shì)。Knappik等［11］在2000年報(bào)道了第一個(gè)全合成抗體庫(kù)。他們根據(jù)抗體可變區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)了7個(gè)VH和7個(gè)VL基因，其CDR為很容易置換的盒式結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了理想的表達(dá)載體，該載體不含干擾的酶切位點(diǎn)，所有元件很容易置換，并預(yù)留了構(gòu)建多種工程抗體或多價(jià)抗體的元件插入點(diǎn)。CDR的突變和隨機(jī)化采用了基于三聯(lián)核苷酸的突變法，7個(gè)VH和7個(gè)VL可組配成49個(gè)子庫(kù)。他們初步嘗試構(gòu)建了一個(gè)容量為2×109的全合成抗體庫(kù)，對(duì)數(shù)十種抗原進(jìn)行篩選，均得到了親和力較高的抗體。隨后一些學(xué)者又構(gòu)建了全合成ScFv噬菌體抗體庫(kù)［12］及Fab抗體庫(kù)［13］，選擇部分使用頻率較高的人抗體胚系基因家族的框架區(qū)基因進(jìn)行人工合成，同時(shí)人工設(shè)計(jì)合成6個(gè)半隨機(jī)CDR區(qū)，通過(guò)重疊拼接延伸PCR的方法合成抗體基因，使庫(kù)容明顯提高，而且70%以上為有功能的高親和力抗體。

2 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵

2.1 PCR技術(shù)的發(fā)展

為了大量擴(kuò)增抗體基因片段，可設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)引物，根據(jù)抗體中某些序列的相對(duì)保守性，利用不同的PCR技術(shù)簡(jiǎn)單有效地?cái)U(kuò)增出全套抗體可變區(qū)基因。一旦多樣的IgV區(qū)基因組能夠擴(kuò)增，從噬菌體抗體庫(kù)中即能得到針對(duì)不同抗原的高親和力抗體。1998年，Daniele Sblattero等［14］根據(jù)人類胚系基因數(shù)據(jù)庫(kù)(V BASE)設(shè)計(jì)一套引物，理論上可以擴(kuò)增所有可變區(qū)基因。隨著胚系基因數(shù)據(jù)的不斷完善和發(fā)展及PCR技術(shù)的成熟，套式PCR、5＇-RACE或3＇-RACE、單細(xì)胞RT-PCR不斷應(yīng)用于抗體可變區(qū)基因的擴(kuò)增，使得抗體的多樣性有了很大提高［15-17］。

2.2 利用大腸埃希菌成功分泌有功能的抗體片段

抗體分子與抗原的結(jié)合，其特異性主要依賴于復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)。大腸埃希菌無(wú)糖基化功能，不能表達(dá)具有效應(yīng)功能的抗體分子。在大腸埃希菌周質(zhì)腔中，能夠模擬分泌抗體的B細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化環(huán)境，抗體片段能夠有效表達(dá)并保持其親和力。在抗體片段如ScFv和Fab的可變區(qū)基因序列的5＇端加入細(xì)菌的信號(hào)肽序列，抗體片段即可分泌到周質(zhì)腔，并在那里完成折疊，成為有功能的蛋白質(zhì)分子。

2.3 有效篩選系統(tǒng)的建立

傳統(tǒng)的篩選方法使用固相化的純化抗原，依賴噬菌體顆粒對(duì)目的抗原的親和力差異來(lái)獲得較高親和力的抗體。而目前，可以在體外用完整的固化哺乳動(dòng)物細(xì)胞、原核細(xì)胞和組織中的天然抗原篩選噬菌體抗體片段［18-19］，在進(jìn)行一維、二維電泳后，仍未能純化的抗原可以通過(guò)硝酸纖維素膜/PVDF膜進(jìn)行篩選，甚至在體內(nèi)進(jìn)行篩選。在體內(nèi)篩選的方法中，噬菌體被注入動(dòng)物血管內(nèi)，非特異性地結(jié)合在所有器官的內(nèi)皮細(xì)胞上，由于無(wú)差異地結(jié)合在普通血管上而被稀釋，可用灌注的方式來(lái)移動(dòng)其分布，這就使特異性結(jié)合在靶器官內(nèi)皮細(xì)胞上的噬菌體被分離出來(lái)，再取出該器官，即可得到目的噬菌體。此方法可以識(shí)別出器官的差異，但由于倫理學(xué)的約束，限制了此類技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

3 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的應(yīng)用

噬菌體展示技術(shù)一般用來(lái)制備2類抗體:一類抗體是用來(lái)識(shí)別人細(xì)胞的表面抗原的單克隆抗體，這類研究的主要目的是研究細(xì)胞蛋白分子的結(jié)構(gòu)和功能，研究疾病發(fā)病機(jī)理、治療方法以及腫瘤的治療。另一類抗體是用來(lái)識(shí)別病毒表面抗原的單克隆抗體，這類研究的主要目的是治療病毒性疾病、對(duì)病毒性疾病作臨床診斷或研究病毒致病機(jī)理。

由于膜蛋白密度的差異及膜分子暴露程度的不同，對(duì)未知抗原的分離鑒定具有很大困難，因而在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)抗體庫(kù)沒(méi)有被應(yīng)用于對(duì)腫瘤特異性抗體的篩選［20］。近年來(lái)，人們通過(guò)改進(jìn)篩選策略，用腫瘤作為靶抗原已從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出許多腫瘤特異性抗體，利用抗腫瘤相關(guān)抗原的單抗與藥物前體、酶或細(xì)胞因子交聯(lián)，靶向定位到腫瘤局部，激活藥物前體使之轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒藥物，在腫瘤局部發(fā)揮細(xì)胞毒作用，以克服藥物所致的全身毒副反應(yīng)，或通過(guò)單抗介導(dǎo)提高腫瘤局部細(xì)胞因子濃度，研究已顯示了較好的靶向治療效果［21］。在目前尚未發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性抗原和令人滿意的腫瘤相關(guān)抗原的情況下，以這種方法篩選抗腫瘤抗體很有價(jià)值。Wiiger MT等［22］利用人乳腺癌細(xì)胞株P(guān)M-1篩選人源全合成單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)得到乳腺癌特異性單鏈抗體scFv173，可與細(xì)胞黏附分子CD166/ALCAM特異性結(jié)合。scFv173有2種特性:可抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲基底膜以及降低了腫瘤在小鼠模型中的增長(zhǎng)。

在治療感染性疾病方面，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)已被應(yīng)用于登革病毒、乙肝病毒、SARS冠狀病毒的研究及單克隆抗體的制備。Cabezas S等［23］利用登革病毒單克隆抗體從被感染的Vero細(xì)胞中直接捕獲病毒顆粒作為抗原篩選人天然噬菌體抗體庫(kù)，獲得了一組特異性噬菌體抗體。Zhang JL［24］構(gòu)建了抗HBsAg抗體庫(kù)，得到2株陽(yáng)性克隆，可溶性的抗HbsAg ScFv可特異性的與HbsAg結(jié)合。在SARS的研究中，篩選出2個(gè)抗核蛋白單克隆抗體和4個(gè)抗刺突蛋白單克隆抗體，其中1個(gè)抗核蛋白單克隆抗體可以識(shí)別一個(gè)人和所有動(dòng)物都具有的保守的抗原表位，但抗核蛋白單克隆抗體不具有中和性;其中2個(gè)抗刺突蛋白S1的單克隆抗體具有很強(qiáng)的中和作用，能夠完全阻止SARS冠狀病毒對(duì)Vero易感細(xì)胞的攻擊，同時(shí)，研究還進(jìn)一步揭示抗刺突蛋白S1的N479殘基是與抗體結(jié)合的重要位點(diǎn)，這為SARS冠狀病毒感染的診斷和治療奠定了基礎(chǔ)［25］。本法也用于輪狀病毒單克隆抗體的制備［26］。

自噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)建立以來(lái)，這一技術(shù)為單克隆抗體的快速規(guī)?；苽溟_(kāi)辟了一條全新的途徑。國(guó)內(nèi)外的一些實(shí)驗(yàn)室先后建立了一批不同性質(zhì)的抗體庫(kù)。Brekke等［27］報(bào)道應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)的第一個(gè)抗體HUMIRA即D2E7(一種能有效控制RA癥狀，防止關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損壞發(fā)生的抗體)已經(jīng)通過(guò)了美國(guó)FDA的認(rèn)證。噬菌體抗體庫(kù)在感染性疾病、自身免疫病、多種癌癥及變態(tài)反應(yīng)性疾病的抗體靶向生物治療方面也得到了廣泛地應(yīng)用。

4 小結(jié)

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)生產(chǎn)的人源抗體為人類疾病的診斷和治療帶來(lái)了希望。噬菌體抗體對(duì)器官移植排斥反應(yīng)的防治及腫瘤的早期診斷、治療，以及手術(shù)及化療后晚期腫瘤的輔助治療均具有廣闊的應(yīng)用前景。不僅如此，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)在抗體人源化、抗體親和力提高、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等方面也顯示出獨(dú)特的應(yīng)用潛力。盡管噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)使單克隆抗體的制備變得簡(jiǎn)單易行，但目前還沒(méi)有廣泛普及并進(jìn)入臨床應(yīng)用。目前面臨的挑戰(zhàn)是，如何最大限度減少非特異性結(jié)合的同時(shí)。最大程度地富集到特異性好、親和力高的新抗體。隨著國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)抗體庫(kù)技術(shù)的不斷改進(jìn)，噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)必將給生物醫(yī)學(xué)研究及人類疾病的診治帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。

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