銀杏葉提取物抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展

王秀鋒，馬瑞陽，景作乾，張朕杰，單風(fēng)平

(中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001)

銀杏系銀杏科銀杏屬植物，為我國特有樹種，自古以來就被譽(yù)為“全身都是寶的活化石”。隨著近些年中藥研究的不斷發(fā)展，銀杏也受到了越來越多的重視，其葉、花、果及外種皮都有不同程度的藥理學(xué)研究，其中，對銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，EGB)的研究更為深入。EGB761是一種標(biāo)準(zhǔn)的銀杏葉提取物，含24%的黃酮(主要是橡黃素、山萘酚和異鼠李素)和6%的內(nèi)酯(含2.8%～3.4%銀杏三內(nèi)酯和2.6%～3.2%銀杏新內(nèi)酯)［1］，它們是EGB中最重要的活性物質(zhì)，其他的組分還包括原花青素、葡萄糖、鼠李糖、有機(jī)酸、D-糖質(zhì)酸和白果酸［2］。目前，EGB制劑已作為一種治療藥物廣泛應(yīng)用于一些心血管和神經(jīng)性功能障礙的疾?。?-4］。近年來，很多研究證明EGB有一定的抗腫瘤作用，還有放射增敏效果，同時，并不增加正常組織的急性放射性損傷［5］，這對于臨床治療腫瘤有很好的應(yīng)用價值。本文著重將EGB抗腫瘤作用的研究進(jìn)展加以介紹。

1 免疫調(diào)節(jié)功能

1.1 對天然免疫的調(diào)節(jié)作用

對應(yīng)激小鼠口服EGB發(fā)現(xiàn)，它能提高腹膜和肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，說明EGB對天然免疫有刺激功能［6］。NK細(xì)胞是天然免疫細(xì)胞，靶細(xì)胞是那些丟失或沒有“自我”標(biāo)記的細(xì)胞，如外來細(xì)胞和突變的腫瘤細(xì)胞［7］。Matsushima等［8］研究表明EGB能增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，在銀杏提取物注射14 d后，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞表面的標(biāo)記物CD56的表達(dá)明顯提高。

1.2 對體液免疫的調(diào)節(jié)作用

EGB能促進(jìn)抗體的生成，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。研究銀杏葉多糖(Ginkgo biloba leaf polysaccharidel，GBLP)對小鼠S 180實(shí)體瘤、腹水瘤的生長抑制作用和對荷瘤小鼠免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)GBLP顯著增加荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)［9］。IgG是血清中的重要抗體，在體液免疫中起主要作用，研究證明，EGB能明顯提高由環(huán)磷酰胺引起的免疫功能低下的小鼠血清IgG水平［10］。

1.3 對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用

細(xì)胞免疫是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。EGB761能促進(jìn)退化的胸腺的再生長，胸腺細(xì)胞的數(shù)量和胸腺的重量都明顯增加［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在精神病患者體內(nèi)T細(xì)胞CD3+、CD4+水平特別低，而且IL-2的分泌水平也很低，在進(jìn)行銀杏葉提取物治療12周以后，患者體內(nèi)CD3+和CD4+水平以及IL-2的分泌水平顯著增加，說明EGB能提高機(jī)體減低的細(xì)胞免疫功能［12］。

2 抑制腫瘤增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

越來越多的研究表明，EGB對腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，而且還能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，EGB可以抑制人乳腺癌細(xì)胞［13］(體內(nèi)和體外)、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝癌細(xì)胞的增殖［14］(體外)，誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系U937的凋亡［15］。在動物試驗(yàn)中，它還能對苯并芘(BP)誘導(dǎo)的鼠前胃腫瘤［16］和二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的肝癌［17］產(chǎn)生遏制作用。研究證明EGB中的山萘酚和橡黃素是具有抗癌作用的活性物質(zhì)［18］，對于臨床實(shí)踐中減少藥物有效用量以及減小副作用有重要的實(shí)際意義。

2.1 降低腫瘤細(xì)胞的表面標(biāo)記物

外周型的苯二氮卓受體(The peripheral-type benzodiazepine receptor，PBR)是一個高親和力膽固醇連接蛋白，在一些特定的人惡性腫瘤和癌細(xì)胞系中過度表達(dá)，是侵襲性腫瘤生長的有效表型標(biāo)記物。在體內(nèi)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EGB761能減少裸鼠體內(nèi)的異種移植物MDA-MB-231乳腺癌和U-87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的PBRmRNA水平，雖然目前還無法解釋PBR對癌癥的初始和進(jìn)展期的具體作用機(jī)制，但已證實(shí)了在一些特定癌細(xì)胞中PBR的過度表達(dá)與其侵襲性有關(guān)，而EGB761能通過降低PBR的過度表達(dá)而減少這種侵襲性表型［19］。

2.2 阻滯腫瘤細(xì)胞進(jìn)入分裂期

細(xì)胞增殖是腫瘤不斷增大的重要原因。P53是腫瘤抑制物，能通過影響細(xì)胞周期進(jìn)而限制細(xì)胞的增殖。研究表明80～320 mg/L的EGB761能提高P53的表達(dá)，以時間-劑量依賴性的方式增加G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量并且減少G2/M和S期的細(xì)胞數(shù)量［20］，因此，EGB能通過提高P53的表達(dá)，使細(xì)胞滯留在G0/G1期，抑制腫瘤的生長。

2.3 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是臨床抗癌治療的重要機(jī)理之一，涉及多個基因，多個信號通路的共同作用。其中線粒體信號通路由天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)、p53和Bcl-2控制［21］。caspase-3是一個重要的凋亡介質(zhì)，能作用于細(xì)胞凋亡的線粒體信號通路的下游。不同濃度的EGB761(0～320 mg/L)孵育人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)，結(jié)果顯示，EGB761能上調(diào)P53mRNA的表達(dá)，下調(diào)bcl-2mRNA的表達(dá)，提高caspase-3的活性，增加HT-29細(xì)胞的凋亡率［20］。因此，EGB761對HT-29細(xì)胞的抑制作用與P53mRNA的表達(dá)的上調(diào)，bcl-2mRNA表達(dá)的下調(diào)，以及caspase-3活性的提高有重要聯(lián)系。

3 抑制腫瘤細(xì)胞的遷移

腫瘤細(xì)胞的遷移是目前腫瘤治療的一大難題，腫瘤內(nèi)血管的生成則為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了通路。研究證明EGB761有抗血管生成作用，通過分析EGB761體外以及雞體內(nèi)的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管狀結(jié)構(gòu)的形成過程發(fā)現(xiàn)，如果用酪氨酸磷酸酶抑制劑進(jìn)行預(yù)處理后，EGB761對ERK和上游激酶MEK(map-erk-kinase)以及(Raf)-1的抑制作用則被逆轉(zhuǎn)，它同時逆轉(zhuǎn)EGB761對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用。通過對Raf-MEK-ERK cascade上游酪氨酸磷酸酶的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸酶的SHP-1是EGB761的一個作用靶點(diǎn)。因此，EGB761通過激活酪氨酸磷酸酶，抑制Raf-MEK-ERK信號通路進(jìn)而產(chǎn)生抗血管生成［22］。

4 抗氧化，清除自由基

抗氧化作用是重要的抗腫瘤機(jī)制之一，而且大量的研究表明由自由基造成的組織損傷和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞對癌癥的發(fā)生進(jìn)程起著重要作用［23］。研究發(fā)現(xiàn)小鼠胃癌前病變的模型組中，血清和胃黏膜中的SOD都下降，而由EGB處理的小鼠組中，血清和組織中的SOD的活性都增加，并且高劑量的EGB能顯著地降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并且減少血清和組織中的MDA。因此，EGB對胃黏膜癌前病變進(jìn)程的阻滯作用與它的抗氧化和自由基清除功能有重要聯(lián)系［24］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)EGB761還能顯著增加谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［25］。

EGB還能誘導(dǎo)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶P1(Glutathione-S-transferase-subunit-P1，GST-P1)的生成，提高細(xì)胞GST的活性。GSTs是一類抗氧化酶，能催化谷胱氨肽和親電化合物(包括內(nèi)源性和外源性的活性氧和環(huán)境中的致癌化合物)的結(jié)合［26］，GST-P1是GST的異形體，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物能誘導(dǎo)HepG2和Hep1c1c7細(xì)胞株中GSTP1的表達(dá)，另有研究發(fā)現(xiàn)EGB能通過Keap1-Nrf2-ARE信號通路誘導(dǎo)生成GST-P1，而EGB如何與Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)發(fā)生相互作用還有待進(jìn)一步的研究［27］。

5 對器官的保護(hù)作用

有毒的致癌物能造成器官的功能障礙和器質(zhì)性損傷，EGB能減少這些有害物質(zhì)對機(jī)體的損害。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與單純CCl4處理的小鼠相比，用EGB預(yù)處理的小鼠能有效地阻止CCl4對肝臟的損傷，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的活性分別下降了54%和65%，而且EGB還能減少肝臟的損傷范圍［28］。另外，臨床研究表明EGB能阻止和降低乳腺癌患者阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性［29］。淀粉樣β蛋白(amyloid β-peptide，Aβ)的積累能引起一定的神經(jīng)毒性，而EGB能減少Aβ對海馬神經(jīng)元和PC12細(xì)胞的損傷，以及對Aβ衍生的傳播配基多肽(Aβ-derived diffusible neurotoxic soluble ligands，ADDLs)的形成產(chǎn)生抑制。通過對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y cells的研究發(fā)現(xiàn)，EGB能阻斷Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、ROS堆積、線粒體功能障礙，以及c-jun-N-terminal kinase(JNK)、extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)和Akt信號通路的活化，從而發(fā)揮EGB對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用［30］。

6 逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多耐藥性

多藥耐藥(Multi-drug resistance，MDR)是惡性腫瘤化療失敗最普遍的原因，其機(jī)制之一是腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)P-糖蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)，由EGB培養(yǎng)的細(xì)胞能通過不同的反應(yīng)(如水解作用、環(huán)氧化作用、重排作用、羥化作用等)將紫杉烯轉(zhuǎn)變?yōu)?種結(jié)構(gòu)各不相同的代謝物。在4種代謝物中有1個烯類化合物表現(xiàn)出對MX-1/Taxol細(xì)胞明顯的逆轉(zhuǎn)MDR的活性，因此，EGB可以通過生物轉(zhuǎn)化作用逆轉(zhuǎn)MDR，從而對EGB的臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)［31］。

7 結(jié)語

銀杏是世界上珍貴的藥用植物，近年來，國內(nèi)外對EGB的研究不斷深入，已有的研究證明了EGB有抗炎、擴(kuò)血管、降血脂、增加冠脈流量等作用，最近越來越多的學(xué)者轉(zhuǎn)向了EGB抗腫瘤作用的研究中，但EGB抗腫瘤的作用機(jī)制復(fù)雜，本文對目前已知的作用機(jī)制進(jìn)行了綜述，更加全面的抗腫瘤作用還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。值得注意的是，EGB對腫瘤有抑制作用，但對正常組織細(xì)胞卻沒有傷害作用，因此，對EGB進(jìn)行深入研究和臨床開發(fā)應(yīng)用具有十分重要的意義。

［1］ Vilar JB，Leite KR，Chen Chen L.Antimutagenicity protection of Ginkgo biloba extract(Egb 761)against mitomycin C and cyclophosphamide in mouse bone marrow［J］.Genet Mol Res，2009，8(1):328-333.

［2］ EGb 761:ginkgo biloba extract，Ginkor［J］.Drugs R D，2003，4(3):188-193.

［3］ Rodriguez M，Ringstad L，Schafer P，et al.Reduction of atherosclerotic nanoplaque formation and size by Ginkgo biloba(EGb761)in cardiovascular high-risk patients［J］.Atherosclerosis，2007，192(2):438-444.

［4］ Luo Y.Alzheimer’s disease，the nematode Caenorhabditis elegans，and ginkgo biloba leaf extract［J］.Life Sci，2006，78(18):2066-2072.

［5］ Ha SW，Yi CJ，Cho MJ，et al.Enhancement of radiation effect by Ginkgo biloba extract in C3H mouse fibrosarcoma［J］.Radiotherapy and Oncology，1996，41(2):163-167.

［6］ Villase?or-García MM，Lozoya X，Osuna-Torres L，et al.Effect of Ginkgo biloba extract EGb 761 on the nonspecific and humoral immune responses in a hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation model［J］.Int Immunopharmacol，2004，4(9):1217-1222.

［7］ Pe＇rez CM.Can ginkgo biloba combat diseases?［J］.P R Health Sci J，2009，28(1):66-74.

［8］ Matsushima H，Morimoto K.The modulation of immunological activities in human NK cells by extracts of ginkgo［J］.Environ Health Prev Med.2009，4(9):361-365.

［9］ 陳群，劉天驕.銀杏葉多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中藥藥理與臨床，2003，19(5):18-19.

［10］ 明亮，張艷，李衛(wèi)平，等.銀杏葉提取物對環(huán)磷胺模型小鼠記憶和免疫的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34(6):414-416.

［11］ Tian YM，T HJ，Zhang GY，et al.Effects of Ginkgo biloba extract(EGb 761)on hydroxyl radical-induced thymocyte apoptosis and on age-related thymic atrophy andperipheral immune dysfunctions in mice［J］.Mechanisms of Ageing and Development，2003，124(8-9):977-983.

［12］ Zhang XY，Zhou DF，Cao LY，et al.The effects of Ginkgo biloba extract added to haloperidol on peripheral T cell subsets in drug-free schizophrenia:a double-blind，placebo-controlled trial［J］.Psychopharmacology(Berl)，2006，188(1):12-17.

［13］ Papadopoulos V，Kapsis A，Li H，et al.Drug-induced inhibition of the peripheral-type benzodiazepine receptor expression and cell proliferation in human breast cancer cells［J］.Anticancer Res，2000，20(5A):2835-2847.

［14］ Li W，Pretner E，Shen L，et al.Common gene targets of Ginkgo biloba extract(EGb 761)in human tumor cells:relation to cell growth［J］.Cell Mol Biol(Noisy-le-grand)，2002，48(6):655-662.

［15］ Yang XM，Chen YC，Chen J，et al.Apoptosis study on human or leukaemia cell line U937 induced by ginkgolic acids from Ginkgo biloba L［J］.Food Science，2006，27:241-246.

［16］ Agha AM，El-Fattah AA，Al-Zuhair HH，et al.Chemopreventive effect of Ginkgo biloba extract againstbenzo(a)pyrene-induced forestomach carcinogenesis inmice:amelioration of doxorubicin cardiotoxicity［J］.J Exp Clin Cancer Res，2001，20(1):39-50.

［17］ Dias MC，Rodrigues MA，Reimberg MC，et al.Protective effects of Ginkgo biloba against rat liver carcinogenesis［J］.Chem Biol Interact，2008，173(1):32-42.

［18］ Kang JW，Kim JH，Song K，et al.Kaempferol and quercetin，components of Ginkgo biloba extract(EGb 761)，induce caspase-3-dependentapoptosis in oral cavity cancer cells［J］.Phytother Res，2010，24(1):S77-82.

［19］ Pretner E，Amire H，Li W，et al.Cancer-related Overexpression of the Peripheral-type Benzodiazepine Receptor and Cytostatic Anticancer Effects of Ginkgo biloba Extract(EGb 761)［J］.ANTICANCER RESEARCH，2006，26(1A):9-22.

［20］ Chen XH，Miao YX，Wang XJ，et al.Effects of Ginkgo Biloba Extract EGb761 on Human Colon Adenocarcinoma Cells［J］.Cell Physiol Biochem，2011，27(3-4):227-232.

［21］ Melet A，Song K，Bucur O，et al.Apoptotic pathways in tumor progression and therapy［J］.Adv Exp Med Biol，2008，615:47-79.

［22］ Koltermann A，Liebl J，F(xiàn)ürst R，et al.Ginkgo biloba extract EGb 761 exerts anti-angiogenic effects via activation of tyrosine phosphatases［J］.J Chromatogr A，2009，13(8B):2122-2130.

［23］ Guiyin S，Weiwen L，Zhiqiang Z，et al.Effects of free radical on the development ofexperimental gastric cancer and precancerous lesions［J］.WorldJ Gastroenterol，1998，6:219-221.

［24］ Jiang XY，Qian LP，Zheng XJ，et al.Interventional effect of Ginkgo biloba extract on the progression of gastric precancerous lesions in rats［J］.Journal of Digestive Diseases，2009，10(4):293-299.

［25］ Hao YR，Yang F，Cao J，et al.Ginkgo biloba extracts(EGb761)inhibits aflatoxin B1-induced hepatocarcinogenesis in Wistar rats［J］.Zhong Yao Cai，2009，32(1):92-96.

［26］ Hayes JD，Pulford DJ.The glutathione S-transferase supergene family:regulation of GST and the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistance［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，1995，30(6):445-600.

［27］ Liu XP，Goldring CE，Wang HY，et al.Extract of Ginkgo biloba induces glutathione-S-transferase subunit-P1 in vitro［J］.Phytomedicine，2009，16(5):451-455.

［28］ Chávez-Morales RM，Jaramillo-Juárez F，Posadas del Río FA，et al.Protective effect of Ginkgo biloba extract on liver damage by a single dose of CCl(4)in male rats［J］.Hum Exp Toxicol，2011，30(3):209-216.

［29］ Yi SY，Nan KJ，Chen SJ，et al.Effect of extract of Ginkgo biloba on doxorubicin-associated cardiotoxicity in patients with breast cancer［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2008，28(1):68-70.

［30］ Shi C，Zhao L，Zhu B，et al.Protective effects of Ginkgo biloba extract(EGb761)and its constituents quercetin and ginkgolide B against β-amyloid peptide-induced toxicity in SH-SY5Y cells［J］.Chemico-Biological Interactions，2009，181(1):115-123.

［31］ Xie D，Zhang Y，Zou J，et al.Biotransformation of a Taxadiene by Ginkgo Cell Cultures and the Tumor Multi-Drug Resistant Reversal Activities of the Metabolites［J］.Chem.Pharm.Bull，2011，59(8):1038-1041.