Z-ATAD-FMK預(yù)處理對癲癇持續(xù)狀態(tài)后大鼠海馬Caspase-12表達(dá)的影響和神經(jīng)元的保護(hù)作用

婁鵬程，王海萍，李光乾，焦穎，林忠東，葉秀云

（1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325027；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第六醫(yī)院、杭州市兒童醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310014）

癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus，SE）可致腦內(nèi)選擇性的神經(jīng)元缺失、壞死、凋亡，膠質(zhì)細(xì)胞增生及海馬硬化[1]；但驚厥性腦損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明。近年來，隨著對SE研究的不斷深入，對SE后腦損傷的機(jī)制有了進(jìn)一步的了解。已有研究[2-3]表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與了SE后腦損傷的過程。而Caspase-12作為ERS凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，在SE后腦損傷中可能起著重要的作用。芐氧羰-丙氨酰-蘇氨酸-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮（Z-ATAD-FMK）是一種Caspase-12抑制劑，能選擇性地阻斷Caspase-12的活性，在近幾年的離體實驗中發(fā)現(xiàn)其具有抗凋亡作用，而在活體實驗中鮮見報道。本研究于大鼠右側(cè)腦室內(nèi)注射Z-ATAD-FMK預(yù)處理后采用氯化鋰-匹羅卡品制作大鼠SE模型，旨在觀察抑制Caspase-12后SE大鼠海馬Caspase-12蛋白表達(dá)的變化，以及對神經(jīng)元病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 清潔級健康雄性成年SD大鼠80只，體質(zhì)量250～300 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[動物許可證號：SCXK（滬）2007-0005]。室溫18～25 ℃，相對濕度70%，人工12 h晝/夜循環(huán)照明，全價營養(yǎng)飼料分籠飼養(yǎng)，大鼠能自由攝食及飲水。

用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對照組（A組）、二甲基亞砜（DMSO）對照組（B組）、SE組（C組）和Z-ATAD-FMK預(yù)處理組（D組）。B組、C組、D組再按大鼠SE后處死時間點不同分為12 h、24 h、72 h組3個亞組，每亞組8只。A組于72 h處死。如果在實驗中由于非實驗相關(guān)因素發(fā)生死亡則按各組死亡動物的只數(shù)給予補(bǔ)上。

1.2 實驗方法

1.2.1 側(cè)腦室給藥方法：B組、C組、D組的大鼠經(jīng)10%水合氯醛（按300 mg/kg）麻醉后，俯臥固定于大鼠腦立體定位儀（KOPF 900型，德國KOPF公司）上，將顱頂保持在同一水平面，延顱頂正中將皮膚切開，約開口1～1.5 cm，充分暴露前囟；參照包新民、舒斯云主編的《大鼠腦立體定位圖譜》，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果確定側(cè)腦室位置，以前囟中央為零點，前囟后-0.8 mm（AP）、中線右側(cè)旁開1.5 mm（LAT）為穿刺點，經(jīng)顱骨鉆孔后，用微量注射器垂直進(jìn)針4 mm穿刺右側(cè)腦室成功后，B組和C組均注入1% DMSO 5μL，D組注入Z-ATAD-FMK（2700 ng，5μL，購自美國biovision公司），注入速度均為1 μL/min，注射完畢后留置5 min，緩慢退針，以骨蠟封閉顱骨鉆孔，然后縫合皮膚，注意保暖，回籠飼養(yǎng)。2 h后腹腔注射匹羅卡品進(jìn)行造模。

1.2.2 SE模型制作：SE模型制作參照周琴等[4]采用的方法，略做改進(jìn)。具體方法如下：采用氯化鋰（購自美國Aldrich Sigma公司）按127 mg/kg劑量腹腔注射，18 h后腹腔注射溴化甲基東莨菪堿（購自浙江瑞新藥業(yè)股份公司）1 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品（美國Aldrich Sigma公司）50 mg/kg。大鼠驚厥按Racine分級法分為：0級：無任何發(fā)作跡象；I級：凝視、咀嚼和須動；II級：點頭、濕狗樣抖動或搔抓；III級：前肢陣攣抽搐；IV級：伴后肢站立的全身強(qiáng)直性發(fā)作；V級：伴有站立并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。當(dāng)大鼠持續(xù)驚厥發(fā)作達(dá)30 min時給予10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射和阿托品（購自浙江瑞新藥業(yè)股份公司）1 mg/kg腹腔注射，如不能緩解驚厥，可重復(fù)給予水合氯醛1～2次，直至驚厥停止，以避免過長時間驚厥發(fā)作致大鼠死亡。驚厥發(fā)作達(dá)到IV級以上，持續(xù)時間達(dá)30 min，解除驚厥發(fā)作后一般狀態(tài)可的大鼠為合格的SE模型大鼠。

1.2.3 標(biāo)本提取與制作：大鼠分別于各時間點，經(jīng)10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉后，斷頭處死。斷頭后迅速剝離顱骨，完整取出腦組織，全腦置于冰盤上，左側(cè)半腦經(jīng)視交叉處垂直離斷，并于冠狀位向后2～3 mm切片。切片放入已預(yù)冷的4%多聚甲醛固定12～24 h，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，用振蕩切片機(jī)從視交叉處開始作冠狀連續(xù)切片，片厚4μm，用于HE染色和免疫組化檢測。每組取2只大鼠，快速分離右側(cè)海馬后，在相同位置垂直于海馬長軸方向切取1 mm×1 mm×3 mm的橫斷面，置預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，制作電鏡標(biāo)本；再經(jīng)1%鋨酸后固定，半薄切片尋找海馬CA1區(qū)，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機(jī)切片后，H-7500型透射電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法（SP法）檢測海馬Caspase-12蛋白表達(dá)：每組取8只大鼠的石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，3% H2O2處理10 min，經(jīng)高壓修復(fù)6 min后，繼而加入兔抗Caspase-12（購自Abcam公司）孵育20 h（4 ℃），生物素標(biāo)記羊抗兔IgG（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）各孵育20 min。以上各步驟之間用0.01 mol/L PBS充分漂洗。然后用DAB/H2O2溶液顯色，蘇木素復(fù)染，漂洗，常規(guī)脫水，透明，封片。細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性信號，分別在海馬CA1區(qū)隨機(jī)觀察5個不相重疊的視野（×400），應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測量陽性部位的平均光密度值（optical density，OD）值，取平均值作為CA1區(qū)Caspase-12的OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)的兩兩比較方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’t T3法。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化 A、B組各時間亞組大鼠海馬CA1區(qū)病理形態(tài)均無異常，表現(xiàn)為層次清晰，排列整齊緊密，核清晰，呈圓形或橢圓形，核仁可見，細(xì)胞邊界清楚（見圖1①）。而C組SE后12 h海馬CA1組織切片可見錐體細(xì)胞排列尚整齊，可見少量神經(jīng)元變性，核染色質(zhì)腫脹、胞漿染色變淺，神經(jīng)元丟失較少；24 h后錐體細(xì)胞病理改變較12 h明顯加重，排列欠整齊，受累神經(jīng)元迅速增多，細(xì)胞體積增大，染色變淺，極性改變顯著累及數(shù)增多；72 h亞組損傷最顯著，受累細(xì)胞數(shù)量最多，錐體細(xì)胞表現(xiàn)為輪廓不清晰，細(xì)胞腫脹明顯，形態(tài)多樣，呈三角形或不規(guī)則形，大小不等，可見“空穴”區(qū)及紅色神經(jīng)元，神經(jīng)元丟失也增加（見圖1②）；而D組各亞組海馬CA1區(qū)也可見不同程度神經(jīng)元變性、死亡，但與C組相比較，D組各時間點海馬水腫明顯減輕，神經(jīng)元丟失減少，海馬CA1區(qū)累及范圍亦有所減?。ㄒ妶D1③）。

圖1 各組海馬組織形態(tài)學(xué)變化（HE，×200）

2.2 電鏡觀察海馬組織CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu) A組大鼠海馬細(xì)胞體積大，核大而圓，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體大小正常，基質(zhì)電子密度適中，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰可辨，胞漿富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體；血管及周圍間隙清楚正常；突觸結(jié)構(gòu)緊密，突觸間隙尚正常，突觸內(nèi)致密物均勻；有髓神經(jīng)纖維示髓鞘結(jié)構(gòu)致密、光滑，神經(jīng)微絲清晰（見圖2①）。

B組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與A組相似（見圖2②）。

C組大鼠海馬SE后12 h可觀察到細(xì)胞核改變，核變小，核膜模糊，部分稍皺縮；細(xì)胞質(zhì)濃縮，個別線粒體稍腫脹。SE后24 h可見核輕度固縮，染色質(zhì)凝結(jié)成塊、邊集；胞質(zhì)濃縮，線粒體空泡化明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；細(xì)胞膜模糊不清，不連續(xù)；突觸間隙增寬；部分少突膠質(zhì)細(xì)胞中度水腫。SE后72 h，神經(jīng)元細(xì)胞核膜模糊、皺縮，異染色質(zhì)邊集；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張，線粒體高度空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體減少；神經(jīng)突觸間隙進(jìn)一步增寬，突觸內(nèi)致密物減少；部分少突膠質(zhì)細(xì)胞重度水腫，伴核內(nèi)水腫（見圖2③）。

D組大鼠海馬SE后12 h，染色質(zhì)呈顆粒狀聚集，核膜尚清晰，核膜增厚，模糊，胞質(zhì)濃縮，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。SE后24～72 h，核膜增厚、模糊，稍皺縮，核輕度固縮，染色質(zhì)凝結(jié)成塊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，線粒體稍腫脹，呈部分空泡樣變性。SE后72 h毛細(xì)血管周圍輕度水腫；髓鞘輕度松解。其超微結(jié)構(gòu)改變程度、累及范圍和細(xì)胞數(shù)目均較C組減輕（見圖2④）。

2.3 Caspase-12免疫組化檢測結(jié)果 A組、B組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白均有少量表達(dá)，但兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（見圖3①）；C組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增加，以72 h為最高（見圖3②），與A、B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）； D組24 h、72 h時間點Caspase-12蛋白表達(dá)量較C組明顯降低（見圖3③）（P<0.01或P<0.05）。見表1。

圖2 各組海馬組織CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)（×15000）

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白表達(dá)（DAB，×200）

表1 各組大鼠不同時間點海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白OD值比較（±s）

表1 各組大鼠不同時間點海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白OD值比較（±s）

與A組比：●●P<0.01；與B組各對應(yīng)時間點比：★★P<0.01；與D組各對應(yīng)時間點比：▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別A組B組Caspase-12 OD值0.0551±0.0065 12 h 24 h 72 h C組0.0538±0.0046 0.0560±0.0068 0.0580±0.0041 12 h 24 h 72 h D組0.0914±0.0093●●★★0.1059±0.0128●●★★▲0.1444±0.0196●●★★▲▲12 h 24 h 72 h n8 888 888 888 FP 0.0814±0.004●●★★0.0926±0.0077●●★★0.1137±0.0186●●★★62.627 0.000

3 討論

SE后可造成持久的腦損傷、認(rèn)知功能受損和癇性發(fā)作復(fù)發(fā)風(fēng)險增加[5]。SE后患者全身及腦生理發(fā)生改變，腦組織對葡萄糖、氧利用減少，興奮性氨基酸尤其是谷氨酸明顯增高，GABA減少；神經(jīng)元突觸后膜抑制作用減弱，神經(jīng)元過度興奮，NMDA受體通道開放，Ca2+流人細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)一系列病理過程，促進(jìn)神經(jīng)元死亡。

本研究發(fā)現(xiàn)C組SE后12 h海馬CA1組織神經(jīng)元丟失較少，電鏡下海馬出現(xiàn)血管周圍間隙水腫；24 h后受累及神經(jīng)元迅速增多，極性改變顯著累及數(shù)增多，電鏡下胞漿內(nèi)部分高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體輕度擴(kuò)張；72 h組受累細(xì)胞數(shù)量最多，錐體細(xì)胞表現(xiàn)為輪廓不清晰，神經(jīng)元丟失也增加，電鏡下細(xì)胞核膜模糊，皺縮，胞質(zhì)染色變深，胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體擴(kuò)張明顯。光鏡和電鏡的結(jié)果均顯示隨時間的推移，神經(jīng)元病理變化過程逐步加重，提示損傷神經(jīng)元在一次SE后的3 d內(nèi)呈進(jìn)行性加重過程，與Mikati等[6]研究結(jié)果一致。D組各時間點海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷情況較C組減輕，Z-ATAD-FMK能改變改善SE后海馬細(xì)胞的病理形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，提示ZATAD-FMK對SE后腦損傷可能有保護(hù)作用。

Caspases-12是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，正常情況下廣泛存在于大鼠的各種組織中，并高水平表達(dá)在肌肉、腎、肝組織中，在腦組織中有適當(dāng)表達(dá)，特別是皮質(zhì)神經(jīng)元、Purkinje細(xì)胞、腦干神經(jīng)元和嗅束神經(jīng)元，并特異性地表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的外膜近胞漿側(cè)，是ERS介導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，當(dāng)ER受到刺激時Caspase-12從ER內(nèi)釋出。Nakagawa等[7]在實驗中發(fā)現(xiàn)Caspase-12基因敲除細(xì)胞對衣霉素誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)性凋亡耐受性明顯較野生株提高，推測Caspase-12是ERS誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子。ZATAD-FMK作為一種人工合成的多肽，不可逆地抑制Caspase-12，具有良好的細(xì)胞通透性，適用于細(xì)胞培養(yǎng)和活體研究。Mao等[8]在利用去甲腎上腺素導(dǎo)致的PC-12細(xì)胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)Z-ATAD-FMK能減少Caspase-12的表達(dá)并緩解細(xì)胞的凋亡；Kosuge等[9]在大鼠海馬腦片培養(yǎng)中采用Z-ATAD-FMK預(yù)處理的海馬細(xì)胞能減輕衣霉素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；Ou等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)t10，c12-共軛亞油酸能誘導(dǎo)乳房腫瘤細(xì)胞Caspase-12的活化，Z-ATAD-FMK能顯著地緩解t10，c12-共軛亞油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但對于腦室內(nèi)注射Z-ATAD-FMK，能否緩解大鼠SE后海馬細(xì)胞的凋亡，是否具有驚厥性腦保護(hù)作用，目前國內(nèi)外鮮見報道。

本實驗中Caspase-12免疫組化檢測結(jié)果提示C組海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白表達(dá)于SE后12 h顯著增加，隨時間延長進(jìn)一步升高，于72 h達(dá)最高點；Z-ATAD-FMK預(yù)處理后D組24 h、72 h時間點Caspase-12蛋白表達(dá)均較C組相應(yīng)時間點的明顯下降，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。因此，本研究結(jié)果提示ESR參與大鼠SE后腦損傷的過程。對于匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠SE模型，隨著SE后時間的進(jìn)展，海馬CA1區(qū)Caspase-12蛋白量表達(dá)呈遞增趨勢。Caspase-12的激活如何導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，Morishima等[11]認(rèn)為活化Caspase-12剪切Caspase-9，進(jìn)而活化Caspase-3，啟動凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。是否還存在其他的凋亡通路，有待進(jìn)一步的實驗研究。

綜上所述，Caspase-12抑制劑Z-ATAD-FMK作為一種Caspase抑制劑，通過抑制ERS介導(dǎo)的Caspase-12，在一定程度上緩解大鼠SE所致的神經(jīng)元損傷，對SE導(dǎo)致的腦損傷具有保護(hù)作用，為SE后腦損傷的臨床治療提供了新的思路。但其在活體的研究甚少，有待深入的探討。

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